不同形态氮添加对毛竹林土壤N2O排放的影响

蒋文婷，田立斌，朱高荻，唐荣贵，林永新，潘灵强，蔡延江*

（1 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州 311300；2 浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州 311300；3 浙江省安吉县灵峰寺林场，浙江安吉 313302；4 福建师范大学地理科学学院，福建福州 350007）

氧化亚氮(N2O)是大气中仅次于二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)的第三大温室气体，百年尺度上单分子N2O的增温潜势(GWP)是CO2的265倍[1]，其对全球变暖的贡献约占6%[2]。除温室效应外，N2O还能在平流层中被进一步氧化为一氧化氮(NO)，进而破坏臭氧层[3]。土壤中排放的N2O占全球总排放量的57%左右[4]，森林土壤N2O排放量约为2.4～5.7 Tg/年[5-6]。工业革命以来，人类活动导致大气氮沉降出现迅猛增长[7]，相应地增加了陆地生态系统氮的可利用性，进而使得N2O排放加剧。

土壤N2O主要是通过硝化和反硝化过程产生的[8]，这两个过程主要受土壤氮素形态、有效氮含量以及硝化和反硝化微生物等因素的影响[9-11]。不同环境下，主导土壤N2O产生的微生物过程差异较大，北方森林地区土壤水分适中且铵根离子(NH4+)富集，硝化作用支配着土壤N2O的排放[12]；而热带森林和亚热带森林地区由于雨水充足易形成厌氧环境且硝酸根离子(NO3-)相对富集，反硝化被认定为土壤N2O的主要产生过程[13]。硝化作用主要由氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌驱动完成，其中NH3氧化成NO2－是硝化作用的限速步骤，由氨氧化细菌(ammoniaoxidizing bacteria, AOB)、氨氧化古菌(ammoniaoxidizing archaea, AOA)的氨单加氧酶催化完成，因此氨氧化菌的研究常利用amoA基因丰度表征其分布水平[14]，而不同生态系统中AOA和AOB对硝化作用的贡献差异较大[15]，N2O通常被认为是硝化过程的副产物。反硝化过程需通过硝酸盐还原酶(nitrate reductase，Nar)、亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，Nir)、一氧化氮还原酶(nitric oxide reductase，Nor)和氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase，Nos)的作用将NO3－还原为N2，N2O则是这一过程的中间产物[16]。研究表明，氮沉降会显著影响硝化菌和反硝化菌[17-18]。低氮添加能显著增加AOA、nirS、nosZ基因丰度，但过量氮添加由于其盐离子的毒害作用以及酸化作用会降低AOA、nirS、nosZ基因丰度[19]。也有研究显示，氮添加显著增加了nirK基因的丰度，但显著降低了nosZ基因的丰度[20-21]，他们认为，nirK基因丰度的增加是由于NO3-的累积造成的。Nos的编码基因nosZⅠ通常被认为是编码N2O还原酶的唯一功能基因，但近期发现了另一个分支nosZⅡ，这一发现进一步深化了氮循环研究，且nosZⅡ基因也广泛存在于土壤中[22]，它们对减少土壤温室气体排放有重要作用。反硝化功能基因nirS和nirK与nosZⅠ和nosZⅡ之间的平衡关系，可以在一定程度上反映出土壤N2O的排放能力[23]。

毛竹(Phyllostachys edulis)是我国亚热带地区的代表性竹种和重要的森林资源，其速生特性及较高的净生态系统生产力使得它在固碳及缓解气候变暖方面发挥着重要作用[24]。我国现有毛竹林面积为467.78万hm2，占竹林总面积的72.96%[25]。短期内的N沉降输入有利于提高毛竹林系统的初级生产力及稳定性[26]，但对于N沉降形势严峻、土壤N相对富集的亚热带毛竹林生态系统而言，可能存在着严重的负面效应，如土壤酸化、生物多样性减少、N2O排放增加等[27-28]。目前氮沉降研究中大多仅注重单一含氮化合物(比如硝酸铵、氯化铵、硝酸钾)的影响[29]，关于不同形态氮对N2O排放的影响还尚无定论，而且各种氮对应的阴/阳离子(KNO3-K+、NH4Cl-Cl－)如何影响土壤N2O排放也鲜有报道。因此，综合探讨不同形态氮及对应阴/阳离子对亚热带毛竹林土壤N2O排放的影响，对于深入理解我国森林土壤N2O排放对大气N沉降的响应机制尤为重要。有研究显示，铵态氮(NH4+-N)与硝态氮(NO3－-N)的施用均能增加土壤N2O排放，且NH4+-N比NO3－-N对N2O排放的促进作用更强[30]；而其他研究表明，NO－-N对NO排放的促进作用更显著[31]。李明等[32]32的研究指出K+、Cl－等离子的添加会影响土壤细菌群落多样性；其他研究表明不同含氯化合物的添加对土壤N2O的排放有不同的效应，KCl的添加对N2O排放有促进作用，而MgCl2的添加减少了N2O的排放[33]。然而，K+、Cl-等无机盐离子对N2O排放影响机理的研究尚有不足之处。鉴于以上研究现状与不足，本研究以毛竹林土壤为研究对象，开展室内培养试验并结合荧光定量PCR技术，测定土壤理化性质、硝化与反硝化微生物功能基因丰度，综合分析不同形态氮及对应阴/阳离子对毛竹林土壤N2O排放的影响，以期了解亚热带毛竹人工林土壤N2O排放过程对大气氮沉降的响应机理，并为提高亚热带人工林氮素利用率、减缓土壤N2O排放提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

研究区位于浙江省湖州市安吉县天荒坪镇毛竹林 (30°49'～30°29'N，119°64'～119°38'E)，属亚热带季风气候，年均气温16.1oC，年均降水量1423.4 mm，无霜期230天(气候统计值1981—2010年)[34]。该样地为粗放经营型毛竹林，林下植被主要有山橿(Lindera reflexa)、络石 (Trachelospermum jasminoides)、紫金牛(Ardisia japonica)、菝葜(Smilax china)、寒莓(Rubus buergeri)、山莓(Rubus corchorifolius)、百步(Stemona japonica)、金星蕨 (Parathelypteris glanduligera)、淡竹叶(Lophatherum gracile)、黑足鳞毛蕨(Dryopteris fuscipes)等。土壤类型为花岗岩发育的红壤土类，0—20 cm表层土壤有机碳为24.31 g/kg、全氮为2.12 g/kg、全磷为0.54 g/kg、全钾为22.59 g/kg、pH为5.34。

于2020年7月，在“浙江农林大学毛竹林林冠氮沉降研究试验基地”，五点取样法用土钻取毛竹林地0—10 cm的表层新鲜土壤，带回实验室，除去新鲜土样中的石头、根系、植物残体等杂物，过2 mm筛后，分成3份，1份自然风干用于土壤基础理化性质的测定；1份置于-80oC冰箱中保存，用于提取DNA测定土壤微生物性质；1份置于4oC冰箱备用(采集土样后3日内进行培养试验)。

1.2 培养试验

设置对照(CK)，3个氮添加处理硝酸钾(KNO3)、硝酸铵(NH4NO3)、氯化铵(NH4Cl)以及氯化钾(KCl)共5个处理，氮添加处理的施氮量为每kg土施N 41.7 mg (基于N 50 kg/hm2换算所得)，相应的KCl则根据氮添加摩尔质量转换后添加，即每kg土添加2.98 μmol。其中，NH4NO3处理中为更好的与其他处理单独比较，其NH4+-N和NO3--N添加量均为 2.98 μmol/kg，氮添加总量为 5.96 μmol/kg。具体操作如下：称取相当于20 g烘干土的新鲜土样置于250 mL培养瓶中，用移液管均匀滴入1 mL各处理溶液，其中CK处理仅添加等量的去离子水。随后将各处理的土壤含水量调节至60%田间持水量，封上保鲜膜，扎孔以保证通气，置于25oC黑暗条件下培养(8个培养天数×5个处理×6个重复)。每次采样前去除培养瓶保鲜膜，置于室内30 min进行气体置换，换气完成后用橡胶塞密封培养瓶，立即抽取20 mL培养瓶内气体作为第一次采气样品，于25oC密封培养4 h，抽取20 mL培养瓶内气体作为第二次采气样品，两次气体样品均用气相色谱仪(Agilent 7890B)测定N2O气体浓度，随后在同一培养瓶内破坏性取样测定铵态氮和硝态氮。另外3个培养瓶同时破坏性取土(共计8个培养天数×5个处理×6个重复，每个培养天数的培养瓶均需破坏性取样)，一部分用于测定可溶性有机碳(DOC)、水溶性氮(WSN)、pH，另一部分用于测定土壤AOA、AOB、nirK、nirS、nosZⅠ、nosZⅡ基因丰度，由于N2O排放高峰时的微生物活性通常较高，且微生物功能基因丰度与N2O排放峰值常呈现出较高的相关性，本研究中仅测定了N2O排放高峰期微生物的功能基因丰度。

1.3 土壤理化性质测定

在测NH4+-N、NO3--N培养瓶内加入KCl溶液(2 mol/L)，按5∶1液土比浸提1 h，浸提过后在170 r/min、25oC条件下充分震荡30 min后过滤，过滤后得到的浸提液采用靛酚蓝比色法测定NH4+-N含量，用双波长差法测定NO3--N含量[35]。土壤pH用煮沸的去离子水浸提(水土比2.5∶1)，于磁力搅拌机上搅拌30 s后静置30 min，上清液用METTLER TOLEDO®Seven Compact型 pH 计 (METTLER TOLEDO, USA)测定。对于DOC、WSN，则称取5 g培养后的鲜土加入25 mL去离子水(水土比5∶1)，170 r/min震荡30 min后，在20oC条件下以3500 r/min的速度离心20 min，离心后过0.45 μm滤膜，用TOC仪器(Multi C/N 3100, Germany)测定。

1.4 氮转化相关功能基因丰度测定

DNA提取：采用试剂盒(MP Biomedicals, LLC)进行土壤微生物基因组DNA提取，具体步骤严格按照试剂盒的操作说明完成。提取所得土壤DNA样品一部分采用NanoDrop2000 (NanoDrop One, USA)测定DNA浓度和纯度，另一部分-20℃低温保存待用。

标准曲线制作：通过预试验，将提取测序正确的质粒标准品从103～108倍进行10倍稀释，每个梯度取1 μL做模板建立标准曲线。

定量PCR检测：扩增反应体系总体积为20 μL，包括SYBR green PCR Master Mi 10 μL，上下游引物各 0.2 μL，DNA 模板 1 μL (1～10 ng)，灭菌超纯水8.6 μL[36]。将加好样品的96-PCR板置于荧光定量PCR仪进行扩增反应，每个样品3个重复。土壤AOB、AOA、nirS、nirK、nosZⅠ、nosZⅡ定量扩增引物序列、片段长度及荧光定量PCR条件见表1。

表1 荧光定量PCR扩增引物Table 1 Fluorescent quantitation PCR amplification primers

1.5 数据计算与分析

式中，F为排放速率，μg/(kg·h)； ρ为N2O-N密度，1.25 kg/m3；V为培养瓶中气体的有效空间，m3；W为置于培养瓶内的烘干土重，kg；ΔC为两次采样时间间隔的气体浓度差；Δt为两次采样的时间间隔；T为培养时的温度，oC。

式中，M表示N2O累积排放量，μg/kg；F表示N2O排放速率， μg/(kg·h)；(Fi+Fi+1)表示同一采样点连续两次气体排放速率之和；i表示第i次采集气体样品；(ti+1-ti)为连续两次采集样品期间所隔天数。

理化指标变化量公式：

用Microsoft Excel 2019软件进行试验数据的处理与计算，采用SPSS 18中ANONA单因素方差分析评估不同处理对土壤NH4+-N、NO3--N、pH、DOC、WSN、N2O排放速率的影响，利用Duncan法检验分析不同处理均值之间的差异显著性。利用线性回归分析方法评估氮转化相关功能基因丰度与N2O排放速率之间的关系。此外，利用Spearman等级相关分析方法分析N2O排放速率与NH4+-N、NO3--N、pH、DOC、WSN之间，N2O累积排放量与土壤NH4+-N、NO3--N、pH、DOC、WSN、 ΔNH4+-N、ΔNO3--N、 ΔDOC、 ΔWSN之间的相关性，所有统计显著性水平设置为P=0.05，最后用Origin 2021软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 土壤N2O排放

除了KCl处理外，KNO3、NH4NO3、NH4Cl处理和CK处理N2O的排放速率均在培养后的第14天出现一个峰值，以NH4NO3处理的排放速率最高，其次是 KNO3与 NH4Cl处理 (图1a)。至培养结束 (第60天)，CK、KNO3、NH4NO3、NH4Cl和 KCl处理N2O累积排放量分别为0.31、1.91、2.67、2.30和0.60 mg/kg (图1b)，KNO3、NH4NO3、NH4Cl和KCl处理累积排放量的增幅分别为524.3%、771.1%、652.7%、98.6%，不同处理间排放量差异显著(P<0.05)。培养前 14 天 CK、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、KCl处理之间N2O累积排放量存在显著差异(P<0.05)，分别为 0.12、0.56、0.71、0.32 和 0.06 mg/kg (图1c)，培养中后期NH4Cl处理的累积排放量显著高于KNO3处理。

图1 不同处理对N2O排放速率与累积排放量的影响Fig. 1 Effects of different treatments on N2O emission rate and emission amount

2.2 土壤理化性质

NH4NO3、NH4Cl处理 NH4+-N浓度在培养期间持续下降，在整个培养期间均值分别为24.19、24.15 mg/kg，与第0天相比，到培养60天时分别降低了91.01%、92.04%，ΔNH4+-N60分别为29.83、31.04 mg/kg；而KNO3处理NH4+-N浓度一直处于较低水平，其均值为1.86 mg/kg，KCl处理在培养结束时NH4+-N浓度增加了2.02 mg/kg(图2a)。土壤NO3--N浓度的变化在氮添加处理和KCl添加处理之间差异较大。含NO3--N的NH4NO3、KNO3处理NO3--N浓度增长较多，ΔNO3--N60分别为51.06、12.12 mg/kg，NH4Cl处理在培养第28天出现峰值，但培养前后NO3--N浓度无显著变化，KCl处理培养到60天时NO3--N浓度增长了3.22 mg/kg (图2b)。

图2 培养过程中土壤NH4+-N、NO3--N浓度的变化Fig. 2 Variation of soil NH4+-N and NO3--N concentrations during incubation

与第0天相比，培养第60天时氮添加处理与KCl添加处理均增加了土壤可溶性有机碳含量，但氮添加处理与KCl添加处理间无显著差异(图3a)。NH4NO3、NH4Cl、KNO3、KCl处理之间水溶性氮(WSN)含量存在显著差异(P<0.05)，培养期间均值分别为38.85、13.51、29.75、2.88 mg/kg。在培养60天时NH4NO3、NH4Cl处理WSN含量增长较多，NH4NO3、NH4Cl、KNO3处理 ΔWSN60分别为 12.78、16.13、2.41 mg/kg (图3b)。

图3 不同处理对土壤可溶性有机碳与水溶性氮含量的影响Fig. 3 Effects of different treatments on soil soluble organic carbon and nitrogen contents

与CK处理相比，KNO3、NH4NO3、NH4Cl及KCl处理均显著降低了土壤pH (图4)。各处理与培养第1天相比，KNO3处理在培养前28天pH降幅与KCl无差异，但在培养第60天时，pH显著低于KCl处理；NH4NO3、NH4Cl处理pH在培养28天时已显著低于CK和KCl处理，至培养结束时，分别比培养第1天时显著降低了0.25、0.22 (图4)。在培养前期 (14 天)，KNO3、NH4NO3、NH4Cl和 KCl处理间pH无显著差异，在培养第28、60天，有K+存在的KNO3、KCl处理的土壤pH均显著高于有NH4+存在的NH4NO3、NH4Cl处理(P<0.05)，表明是NH4+降低了土壤pH，K+、Cl－和NO3-对土壤pH的影响较小 (图4)。

图4 不同处理对土壤pH的影响Fig. 4 Effects of different treatments on soil pH

2.3 土壤氮循环相关功能基因丰度

在培养第14天时，测定了与土壤硝化和反硝化作用相关的功能基因丰度(图5)。CK处理的AOA基因丰度显著低于KNO3、NH4NO3、NH4Cl和KCl处理，但这4个处理之间无显著差异(P>0.05)。NH4NO3和NH4Cl处理的AOB基因丰度显著高于KCl处理，且KCl、NH4NO3、NH4Cl三者显著高于CK和KNO3处理，但CK和KNO3处理之间无显著差异(P>0.05)。

图5 不同处理土壤氮转化相关功能基因丰度Fig. 5 Abundance of functional genes related to soil nitrogen transformation under different treatments

无机氮和KCl添加处理的nirK基因丰度均高于CK，NH4NO3处理nirK基因丰度最高，且与其他处理有显著差异(P<0.05)，而nirS基因丰度在KNO3、NH4NO3、NH4Cl和KCl添加处理间无显著差异(P>0.05)。土壤中nosZⅠ基因丰度较nosZⅡ略高，但两者的丰度变化趋势相似，外源氮和KCl添加处理的nosZⅠ、nosZⅡ基因丰度均低于CK处理，NH4Cl与KNO3处理间存在显著差异(P<0.05)，而NH4NO3与NH4Cl、KNO3处理间无显著差异(P>0.05)。

2.4 土壤N2O排放与各测定因子的相关关系

整个培养期间(0—60天)的N2O排放速率与NO3--N、WSN呈显著正相关，与pH呈显著负相关(P<0.05) (表2)。N2O峰值排放速率(培养第14天)与NO3--N、NH4+-N、WSN以及nirK丰度呈显著正相关(P<0.05)，与pH、nosZⅠ、nosZⅡ显著负相关(P<0.05，表2，图6)。培养前14天的N2O累积排放量仅与 ΔNO3--N呈极显著相关(P<0.01，表3)。而在培养后期(14—16天)及整个培养期(0—60天)的N2O累积排放量与 ΔNH4+-N、ΔNO3--N及 ΔWSN均呈显著相关(P<0.05，表3)。

表2 N2O排放速率与土壤NO3－-N、NH4+-N、可溶性有机碳 (DOC) 、水溶性氮(WSN) 及pH的相关性(r)Table 2 Correlation between N2O emission rate and contents of soil NO3－-N, NH4+-N, dissoved organic carbon (DOC),water soluble nitrogen (WSN) and pH

图6 土壤氮转化相关功能基因AOA、AOB、nirK、nirS、nosZⅠ、nosZⅡ丰度与N2O峰值排放速率相关性分析Fig. 6 Relationships between the abundance of functional genes AOA, AOB, nirK, nirS, nosZⅠ, and nosZⅡrelated to soil N transformation and peak N2O emission rate

表3 土壤NO3－-N、NH4+-N、可溶性有机碳 (DOC) 、水溶性氮(WSN)变化量与N2O累积排放量的相关性(r)Table 3 Correlation between changes of soil NO3－-N,NH4+-N, dissoved organic carbon(DOC), water soluble nitrogen (WSN) and cumulative N2O emission

3 讨论

3.1 氮形态对土壤N2O排放的影响

添加NH4Cl与KNO3均显著提高了毛竹林土壤N2O排放，且前者的促进作用更为显著。本研究结果与王磊等[42]的研究一致，他们认为NH4+在转化为NO3-的硝化过程中也能产生N2O，即NH4+-N可通过硝化、反硝化两个过程生成N2O，较等量的NO3--N仅经反硝化一个过程生成N2O的效率更高，故而NH4Cl添加的土壤N2O排放量较KNO3处理更高。然而与本研究结果相反，Zhou等[43]发现NO3--N添加对N2O的排放有更强的促进作用[44]，这可能是过量的NH4+-N会抑制氨氧化细菌的活性。本研究中，NH4Cl处理的土壤NH4+-N含量显著高于KNO3处理，土壤AOA、AOB丰度也较高，且ΔNH4+-N与N2O累积排放量显著相关(P<0.05)。有研究发现，AOA和AOB所携带amoA基因，会将NH3氧化生成羟胺(NH2OH)，NH2OH会在细胞色素P460作用下以NO为中间体转化为N2O，另外在硝化过程中NH2OH也会因化学分解而释放出N2O[45-46]，而NH4+-N积累会刺激土壤AOA、AOB的增长。另外，NH4Cl处理水溶性N (WSN)在培养28天后增加，WSN矿化所产生的NH3可能会刺激AOB和AOA生长。由此表明，NH4Cl添加可以通过增加硝化作用的底物和氨氧化微生物数量来促进土壤硝化作用，从而促进N2O的产生[47]。由此可知，硝化过程排放的N2O增多可能是造成NH4Cl处理土壤N2O排放量高于KNO3处理的原因之一。

KNO3处理土壤中的NO3--N含量显著高于NH4Cl处理，且其nirK基因丰度在数值上也相对高于NH4Cl处理，但与NH4Cl处理无显著差异。NO3--N与nirK作为反硝化作用的底物与功能基因，培养前期NO3--N、nirK的增加会促进土壤反硝化作用，进而增加N2O的排放[48]。本研究还发现，N2O排放速率与NO3-、nirK丰度显著正相关，并且ΔNO3--N不论在培养峰值前期还是整个培养过程均与N2O累积排放量显著相关(P<0.05)。由此，本研究认为以NO3--N为底物的反硝化过程所产生的N2O是导致KNO3培养前期N2O累积排放量高于NH4Cl处理的另一重要原因。驱动反硝化过程的微生物属于异养微生物，反硝化作用的顺利进行需要充足的有机碳，Dandie等[49]的研究表明，有效碳的增加会使反硝化菌的数量增加。KNO3、NH4Cl处理直接或间接为反硝化作用提供了充足的底物，且培养结束时均提高了可溶性有机碳(DOC)的含量，底物与有效碳的增加综合作用，刺激nirK型反硝化微生物增长，促进NO2-被还原为NO，间接刺激反硝化过程造成N2O排放增加[50]。然而在培养中后期(14—60天)，KNO3处理N2O累积排放量显著低于NH4Cl处理，这可能是由于NH4Cl处理后期将矿质氮经硝化反硝化作用转化为N2O的同时导致土壤酸化而造成的结果[51]。本研究发现培养中后期N2O累积排放量与矿质氮变化量显著相关，而N2O排放速率与pH、nosZⅠ、nosZⅡ显著负相关。NH4Cl添加处理培养后期，土壤中的pH显著低于KNO3处理，且较CK处理有所降低，土壤pH的降低会减弱NH3的有效性从而抑制自养硝化[52]，同时较低的土壤pH可能通过NO2-的化学反硝化作用抑制N2O还原酶活性[53]，降低反硝化功能基因nosZⅠ、nosZⅡ丰度，减弱N2O还原为N2过程，进而提高了N2O排放量。因此NH4Cl处理在培养后期N2O累积排放量高于KNO3处理，有可能是由于土壤酸化而导致N2O还原为N2这一过程减弱而引起的。

NH4NO3处理作为NH4+-N与NO3--N的混合氮对N2O的排放有协同作用，N2O累积排放量分别是KNO3处理与NH4Cl处理的1.40和1.16倍，这一结果与北京林业大学实验林场的研究结果[54]相近。在本研究中，与NH4Cl处理相比，NH4NO3由于NH4+-N、NO3--N的同时添加，在培养结束后所累积的矿质氮含量更高，为微生物硝化、反硝化作用提供更充足的原料，进而促进土壤N2O排放[55]。而与KNO3处理相比，NH4NO3处理N2O排放更高的原因与NH4Cl处理相似，但NH4NO3处理比KNO3处理添加了更多的NH4+-N。再者，需要指出的是，虽然NH4NO3、NH4Cl处理中所增加的NH4+-N容易被固定在黏土矿物的晶格中而成为“固定态铵”，不能被微生物直接利用[56-57]，但大量的NH4+添加如果超出土壤NH4+的固持量，剩余的NH4+-N会被硝化细菌利用转化为NO3--N以及中间产物N2O[42]。综合这些原因可能造成了KNO3处理在培养后期，N2O累积排放量低于NH4NO3、NH4Cl处理。

3.2 阴阳离子对土壤N2O排放的影响

KCl处理在培养前期N2O累积排放量低于CK处理，可能是因为Cl-的添加降低了亚硝化细菌数量[58-59]。但在培养结束时(第60天)，KCl处理的N2O累积排放量是CK处理的2倍左右，这可能与氯离子添加导致土壤pH降低(图4)而抑制了反硝化过程中的N2O还原酶活性有关，从而增加了N2O的排放。

K+的添加也有可能促进N2O的排放。由于K+与NH4+的离子半径接近，K+同样能被2:1型黏粒矿物所固定，从而易置换出土壤中的NH4+[60]。有研究表明，当K+与NH4+共存时，土壤固K+与NH4+量，在多数情况下，先施离子固定量大，即存在“先入为主”的现象[61]。本研究中KCl处理的添加使得K+率先进入土壤中，K+置换出了土壤中原有的NH4+，增加了土壤中矿质氮的含量，导致KCl处理在培养结束时NH4+含量增加了2.02 mg/kg，NO3-含量增加了3.22 mg/kg，从而促进硝化作用，进而增加了反硝化作用的底物(NO3-)，使反硝化作用增强，N2O排放量增加。近期，亦有研究证明K+的添加能增强异养反硝化作用[62]。K+、Cl-共同作用使KCl处理增加了土壤NH4+含量以及AOA、AOB、nirK基因丰度，但降低了nosZⅠ、nosZⅡ的基因丰度，即加强了硝化作用和反硝化作用中亚硝酸盐还原为N2O的过程，然而降低了N2O还原至N2的过程，因此提高了N2O的排放量。

4 结论

KNO3、NH4NO3、NH4Cl添加均增加了毛竹林土壤N2O累积排放量，单施NH4+-N的促进作用显著高于NO3--N，NH4NO3添加对N2O排放的促进作用更强。NH4+-N施入土壤后，可提高土壤中AOA、AOB、nirK丰度，同步增加硝化和反硝化作用，其还可以显著降低土壤pH，进而抑制nosZⅠ、nosZⅡ丰度，弱化N2O还原作用，因此，铵态氮增加N2O排放的效果较强。K+、Cl-对土壤N2O排放的影响是间接的，而且对N2O排放的促进作用较弱。因此，在毛竹林生态系统中应尽量减少铵态氮的施用，以减少N2O的排放。