杜鹃素对LPS/GalN诱导雏鸡肝损伤的保护作用

李双秋，吴迪，姜爱民，刘子仪，张 勇，谢光洪

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

肝脏是机体最大的消化腺，负责代谢和解毒，可以将毒物、药物分解成小分子物质以便进一步吸收、排泄，从而保护动物体免受毒物、药物对的破坏。肝损伤诱发的肝脏硬化、纤维化等病理变化不仅严重威胁着人类健康，同时也严重制约着畜牧养殖业的发展。我国畜禽业由于饲养环境不当、饲料保管不当，导致肝损伤情况持续增多，但目前又没有准确有效的防治措施，严重制约畜禽业的可持续发展。引起肝损伤的主要原因包括细菌、霉菌、酒精、病毒和化学物质。该病的防治不仅一直困扰着临床医生，而且也是兽医畜禽养殖业面临的重要课题[1-2]。脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(GalN)是构建肝损伤模型最常用的药物，在新型肝保护剂的研究和开发中得到了广泛的应用[3]。LPS作为革兰阴性菌的主要成分，可引起肝损伤。由于GalN在肝脏组织中的选择性代谢，GalN与LPS共注射小鼠体内可明显增加肝脏对LPS的敏感性。因此，我们建立LPS/GalN诱导的肝损伤模型评价药物的应用效果。中药具有作用靶点多，毒副作用少，价格低廉，不易产生耐药性，不存在兽药残留问题等优点，常被作为添加剂添加在饲料中。杜鹃素是从杜鹃花中提取的2，3-二氢黄酮类化合物药物，已被证明对乳腺炎、过敏性哮喘和TNBS诱导的结肠炎症具有显著的治疗效果。研究报告显示杜鹃素具有抗氧化、抗炎和抗菌活性[4-6]。同时，杜鹃素可以通过上调Nrf2信号通路表达和自噬来改善APAP诱导的肝毒性[7]。体内研究表明，杜鹃素对IL-1β刺激的人骨关节炎软骨细胞具有抗炎作用[8]。然而，有关应用杜鹃素治疗雏鸡肝损伤作用的研究尚未见报道。因此，本研究旨在建立LPS/GalN诱导雏鸡肝损伤模型，评价杜鹃素对雏鸡肝损伤的保护作用，并初步研究其作用机制，以期为杜鹃素的兽医临床应用提供试验依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂杜鹃素粗提物(60%)；LPS、D-氨基半乳糖、生理盐水、甲醛、乙醇、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、TRIzol、氯仿、异丙醇、DEPC水、第1链cDNA反转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒。

1.2 主要仪器DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱；TGL-16B高速台式离心机；VIS-7220可见光分光光度计；XD-811L半自动生化分析仪；DK-8D水浴锅；BIO-RAD iMARK酶标仪；Invitrogen AME 3300电子显微镜；BIO-RAD CFX CONNECT荧光定量PCR仪。

1.3 试验动物1日龄麻黄雌性雏鸡35只，购自佛山市南海种鸡场。

1.4 杜鹃素制备杜鹃素(纯度60%)使用浓度梯度分别为20,40和80 mg/kg。精密称取杜鹃素后，先溶于无水乙醇中，然后溶于生理盐水到使用浓度。充分混匀，置4℃下保存、待用。

1.5 LPS和GalN溶剂配制把LPS和GalN分别与生理盐水根据使用浓度混匀。置4℃下保存、待用。

1.6 试验动物分组与处理将35只1日龄健康麻黄雏鸡平均分为空白组、LPS/GalN模型组、杜鹃素低、中、高剂量组(以下分别简称空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)。空白组和模型组灌喂相同剂量生理盐水，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌喂杜鹃素20，40和80 mg/kg(BW)。除空白组外，其他4组在第3次给药杜鹃素1 h后连续3 d 腹腔注射LPS/GalN。各组进行隔离饲养，试验期1周。最后一次腹腔注射LPS/GalN 24 h后，各组雏鸡心脏采血致死，取肝脏冻存用于以下试验。

1.7 血清的制备雏鸡心脏采血，3 000 r/min离心10 min，将血清分装在 1.5 mL离心管中，置-20℃保存，待测。

1.8 肝脏组织匀浆的制备称取冻存肝脏组织0.1 g 于2 mL离心管中，加0.9 mL生理盐水，使用组织匀浆器磨成10%的组织匀浆，4 500 r/min离心10 min，上清移至1.5 mL离心管，置于-20℃保存。待测。

1.9 AST、ALT、T-SOD和GSH-Px酶学活力的测定AST和ALT使用收集的血清进行微板法测定，T-SOD和GSH-Px使用制备的肝脏组织匀浆进行分光光度计法测定，测定方法均根据试剂盒说明书要求进行。

1.10 qRT-PCR检测IL-1β、TNF-α、iNOS和COX2称取冻存肝脏组织0.1 g，使用液氮研磨至粉末状，移至1.5 mL灭RNA酶离心管中，用TRIzol试剂从肝脏中提取总RNA。反转录采用赛默飞公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit来进行。反转录得到cDNA模板，进行qRT-PCR扩增反应，用全式金TransStart®Tip Green qPCR SuperMix试剂盒进行实时定量PCR反应。使用BIO-RAD CFX CONNECT荧光定量PCR仪进行扩增反应。具体条件如下：设置温度循环为94℃，30 s；94℃ 作用5 s、55℃作用15 s与72℃作用10 s，循环数40次。选取β-actin作为内参，采用 2-ΔΔCt公式进行数据分析处理。所用引物为北京生工生物有限公司提供，用于qRT-PCR的引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2 结果

2.1 肉眼观察杜鹃素对LPS/GalN刺激雏鸡肝脏的影响应用LPS 250 μg/kg和GalN 250 mg/kg腹腔注射3 d后雏鸡精神状况差，体征无明显中毒症状，雏鸡消瘦，与空白组相比，LPS/GalN处理组增重率明显降低，杜鹃素预处理组增重率无明显变化 (图1)；最后1次给药24 h后处死雏鸡，剖检雏鸡肝脏，观察肝脏组织病理学变化，眼观可见，与空白组相比，LPS/GalN处理组肝脏明显肿大、且呈土黄色，易碎，表面有不同程度坏死灶和出血点。与LPS/GalN处理组相比，杜鹃素预处理组，随着浓度增加，相应病理变化明显减轻(图2)。可初步判断该实验造模成功，且杜鹃素对LPS/GalN诱导雏鸡肝损伤具有保护作用。

图1 雏鸡日增重率

2.2 杜鹃素降低雏鸡肝损伤模型血清中ALT/AST酶学活力由图3可知，与空白对照组相比，模型组雏鸡的血清中ALT/AST酶学活力显著升高。而杜鹃素预处理组，低、中、高剂量组雏鸡的ALT/AST酶学活力均显著低于模型组，且高剂量组基本恢复到空白组水平。

2.3 杜鹃素改善雏鸡肝损伤病理组织形态学变化由图4可知，空白组肝脏结构完整，肝细胞形状均匀，呈索状排列；模型组肝脏部分肝细胞核消失，胞浆内有大量空泡，细胞间隙出现血细胞，细胞结构消失；与模型组相比，杜鹃素低剂量组肝细胞间隙血细胞减少，肝门静脉管壁结构相对完整，胞浆内空泡减少；杜鹃素中剂量组仍有少量肝细胞细胞核碎裂或溶解，但肝组织基本结构清晰，细胞间隙内仍有少量血细胞；杜鹃素高剂量组未见明显病理变化，肝组织结构清晰，肝细胞分布均匀。

*.表示P<0.05;**.表示P<0.01;***.表示P<0.001

A.空白组；B.模型组；C.低剂量组；D.中剂量组；E.高剂量组

2.3 杜鹃素增强雏鸡肝损伤模型中SOD和GSH-PX活性由图5可知，与空白组相比，模型组肝组织中SOD和GSH-PX酶学活力显著减低，杜鹃素预处理组与模型组相比，SOD和GSH-PX酶学活力显著升高，且SOD高剂量组基本恢复正常，与空白对照组相比差异不显著。

图5 肝组织匀浆中SOD和 GSH-Px酶学活力

2.4 杜鹃素降低雏鸡肝损伤模型中TNF-α和IL-1β mRNA表达量由图6可知，与空白组相比，模型组肝组织中TNF-α和IL-1β mRNA表达量显著升高，其余杜鹃素预处理组与模型组相比，TNF-α和IL-1β mRNA表达量呈剂量依赖性显著降低。

图6 IL-1β(左)和TNF-α(右) mRNA表达情况

2.5 杜鹃素降低雏鸡肝损伤模型中iNOS和COX2 mRNA表达量由图7可知，与空白组相比，模型组肝脏组织中iNOS和COX2 mRNA表达量显著升高，其余杜鹃素预处理组与模型组相比，TNF-α和IL-1β mRNA表达量呈剂量依赖性显著降低。

图7 iNOS(左)和COX2(右) mRNA表达情况

3 讨论

兴安杜鹃科植物作为传统中草药已被应用多年，人们主要用它的干燥叶子和根部来治疗慢性气管炎和支气管炎。杜鹃素是从该植物叶子中提取出来的一种黄酮类中药单体成分，现已明确其化学结构并可以人工大量合成，目前临床上仅作为镇咳药被广泛使用[9]。研究表明，它还具有许多其他的生物学活性，如抗氧化、抗炎、免疫抑制等作用[10]。XIONG等[11]证明杜鹃素对小鼠T细胞具有免疫抑制作用。研究也表明杜鹃素对免疫性大鼠肝损伤具有保护作用。肝脏是机体物质消化和代谢的重要器官，参与了机体各种物质的代谢过程。它既是机体营养物质转化的重要枢纽，同时也是细菌毒物进入机体排泄和解毒的主要场所。肝脏发挥着举足轻重的作用，所以也被各种细菌毒物最先侵害。大量或长期食入细菌污染食物往往会造成肝损伤，不仅影响畜禽经济价值，严重的则会引发全身脏器衰竭[12]。由于畜禽饲养环境受多重因素影响，常有细菌滋生，而LPS是大肠杆菌等革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是大肠杆菌诱发肝损伤的主要毒力因子。LPS进入肝脏后，激活机体天然免疫系统以Kuffer细胞为主的炎性细胞开始清除LPS，清除过程中产生氧自由基等各种有毒介质，在清除LPS时较高浓度的活性氧自由基 (ROS) 会造成肝脏损伤。据报道，GalN通过触发肝细胞氧化应激导致脂质过氧化。并且GalN在肝组织中的选择性代谢，GalN与LPS共注射可明显提高肝脏对LPS的敏感性。LPS和GalN是构建肝损伤模型最常用的药物，在新型肝保护剂的开发和开发中得到了广泛的应用[13]。而目前有关杜鹃素对LPS/GalN致雏鸡肝损伤是否有防治作用，其剂量、效果如何未见报道。

前期研究发现，雏鸡腹腔注射LPS后，肝脏出现了严重的脂肪变性，肝细胞间隙炎性细胞的数量显著增多，主要表现为广泛的炎性细胞浸润。本试验发现杜鹃素能改善LPS/GalN诱导的雏鸡肝脏病理组织学损伤，肝细胞索附近炎性细胞浸润减少甚至恢复正常。ALT/AST的渗漏是肝损伤的一个典型特征，提示肝细胞坏死和严重的线粒体功能障碍。当肝细胞损伤后ALT/AST释放入血，血清中活性升高。在本试验中，杜鹃素可以显著降低LPS/GalN诱导肝损伤雏鸡血清中ALT/AST活性，此实验结果证实了杜鹃素对肝功能的恢复作用。

LPS进入肝脏时产生大量的ROS，导致肝脏产生脂肪代谢障碍，肝脏发生脂质过氧化损伤和细胞变性[14-15]。杜鹃素拮抗LPS/GalN诱导肝损伤可能与抗氧化反应有关。通过检测肝组织中SOD和GSH-Px酶学活性验证了这一猜想。LPS/GalN抑制的抗氧化酶SOD和GSH-Px水平被杜鹃素预处理后上调。与杜鹃素对过氧化氢诱导的人内皮细胞EA.hy926凋亡的保护作用机制一致[16]。

越来越多的证据表明炎症细胞因子在肝损伤的发生发展中起着关键作用，如IL-1β和TNF-α。并且iNOS催化的NO过度分泌可加重肝脏炎症，COX2上调是氧化应激所致炎症的特征[17-18]。通过RT-PCR检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、iNOS和COX2。杜鹃素可以显著的降低LPS/GalN处理后增加的TNF-α、IL-1β、iNOS和COX2 mRNA表达量。与杜鹃素通过抑制AKT和NF-κB信号通路的激活来保护LPS诱导的帕金森病大鼠模型的效果一致[19]。

综上结果表明，杜鹃素预处理后肝脏组织结构和肝功能指标显示出明显的防治作用，其中灌胃80 mg/kg杜鹃素防治效果较好，但杜鹃素具体的保肝解毒机理还有待进一步研究。