17β-雌二醇抑制LPS诱导Raw264.7细胞炎症反应及其作用机制

余紫薇，王晓杜，罗通旺，姜 胜，巴少波，王 磊，宋泉江，周 彬，宋厚辉，邵春艳

(浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室, 浙江 杭州 311300)

子宫内膜炎是一种常发生于奶畜产后的生殖系统疾病，可引起奶畜子宫复旧不全、产奶量下降、受孕率降低甚至不孕，发病率高达 10%～20%，严重影响奶畜的生产性能，给奶畜养殖业造成巨大的经济损失，阻碍养殖业的健康发展[1-3]。导致子宫内膜炎发生最直接的原因是病原微生物感染，但同时也受机体性激素周期性变化的影响[4-7]。大量研究显示，当奶畜机体雌激素水平降低时，更易感染子宫内膜炎[8-10]。研究显示，雌激素不仅对生殖系统有不可缺少的作用，对免疫系统也有重要的调节作用[11-13]。17β-雌二醇(17β-E2)是一种甾体雌激素，是雌性动物生殖阶段最主要的性激素[14]。脂多糖(LPS)是革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，具有很强的致炎活性，能诱导细胞炎症因子不同程度表达，在体外试验中常用于诱导不同细胞构建细胞炎症模型[15-16]。截止目前，关于雌激素对子宫内膜炎的保护作用及其作用机理还不甚明确。因此本试验首先添加17β-E2进行预处理，再以LPS诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞炎症，通过测定细胞炎性因子IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA的表达量和细胞内及上清中IL-1β的蛋白表达量，探究17β-E2对Raw264.7细胞炎症的保护作用，并研究其对炎症通路NF-κB信号通路相关因子蛋白水平的调控，以期揭示17β-E2抑制LPS诱导的Raw264.7细胞炎症机制，为奶畜子宫内膜炎的防控与治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂细胞株小鼠巨噬细胞Raw264.7购自中国科学院上海细胞库；17β-E2、PHTPP(ERβ抑制剂)、LPS(O111:B4)和5′-三磷酸腺苷(ATP)购自Sigma公司；ICI 182 780(ER抑制剂)购自Abcam公司；DMEM培养基、无血清无酚红培养基、PBS(pH7.2)、0.25% Trypsin-EDTA和双抗购自Gibco公司；IL-1β检测试剂盒购自RD公司；抗体p-IκBα、IκBα、PARP、IL-1β和NF-κB p65购自CST公司；MPP(ERα抑制剂)和anti-β-actin购自Santa Cruz公司；qRT-PCR荧光定量检测试剂盒购自TaKaRa公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验仪器超净操作台(苏州净化)；移液枪(Eppendorf)；电动移液器(Bio-Rad)；超声波细胞破碎仪(宁波新芝)；蛋白电泳仪(Bio-Rad)；台式高速冷冻离心机(Beckman)；多功能酶标仪(Bio Tek)；制冰机(宁波格兰特)。

1.3 LPS最佳作用浓度及时间的筛选Raw264.7细胞培养于含有10% FBS的DMEM培养液中，待细胞长满后用0.25% Trypsin-EDTA消化，调整细胞密度为6.5×106个/L，200 μL/孔接种至96孔细胞板，待细胞长至80%左右时，分别向细胞上清中添加LPS，其终质量浓度分别为0，1，10，100和1 000 μg/L，在收集细胞前30 min再加入ATP(终浓度5 mmol/L)，分别于LPS刺激后1，2，4和8 h收集细胞，用于TLR4、IL-1β和IL-18 mRNA水平检测。

1.4 17β-E2预处理及细胞分组为研究17β-E2对细胞炎症的作用效果，在Raw264.7细胞长至80%左右时，将细胞培养液更换为无血清无酚红培养基。先向细胞中加入17β-E2(终浓度100 nmol/L)孵育24 h，再加入LPS(终质量浓度1 000 μg/L)作用4 h，在收集细胞前30 min再加入ATP(终浓度5 mmol/L)。为研究雌激素受体及其亚型对17β-E2的抑制效果，在加入17β-E2前30 min先分别加入ICI 182 780/MPP/PHTPP(终浓度均为250 nmol/L)，再依次加入17β-E2、LPS和ATP，并分别设置空白组(Mock)、对照组(DMSO)、LPS组和E2/ICI 182 780/MPP/PHTPP单独对照组。

1.5 qRT-PCR法检测Raw264.7相关因子mRNA表达根据试验分组，收集各组细胞，加入TRNzol裂解液提取细胞RNA，根据反转录试剂盒说明，将RNA反转录为cDNA，使用实时荧光定量试剂盒进行qRT-PCR检测。用DNAStar与Beacon Designer软件设计引物，TLR4、IL-1β、IL-18、NLRP3和β-actin具体引物序列见表1，所用引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。各组细胞分别设置3个复孔，记录各孔Ct值，采用分析2-△△Ct法对结果进行。

表1 引物序列

1.6 Western blot法检测Raw264.7相关蛋白表达根据试验分组，收集各组细胞，加入适量细胞裂解液及1%蛋白酶抑制剂，冰上吹打后超声，4℃，12 000 r/min 离心15 min后取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。上样量为20 μg，制胶后进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜3次，分别用IL-1β、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、PARP、β-actin一抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次。滴加ECL显色液显影拍照，并用Image J软件对各蛋白表达情况进行灰度值分析。

1.7 ELISA法检测Raw264.7细胞上清中IL-1β含量根据试验分组，收集各组细胞上清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清中IL-1β含量变化，按照试剂盒说明书开展试验，用酶标仪测定各组吸光度。

1.8 细胞免疫荧光法检测NF-κB p65在细胞内的表达和定位按上述分组进行制备细胞爬片，用4%多聚甲醛固定爬片15 min，0.5% Triton X-100室温通透20 min 1% BSA室温封闭30 min。移除封闭液，每张爬片滴加1∶400稀释的一抗，4℃孵育过夜，PBST 清洗爬片3次，移除多余液体后滴加1∶500 稀释的荧光二抗，37℃孵育1 h。PBST清洗爬片3次，滴加1∶1 000稀释的DAPI避光37℃孵育5 min，封片，荧光显微镜下观察采集图像。

2 结果

2.1 LPS对Raw264.7细胞炎性相关因子mRNA表达的影响以不同质量浓度LPS分别作用Raw264.7不同的时间，通过qRT-PCR法检测Raw264.7细胞中TLR4、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平。结果如图1所示，与Mock组相比， 1 000 μg/L浓度的LPS作用Raw264.7细胞4 h时，TLR4、IL-1β、IL-18 mRNA表达均极显著提高(P<0.01)。因此后续试验选取1 000 μg/L的LPS作用Raw264.7细胞4 h为本试验的体外研究细胞炎症模型。

2.2 17β-E2对LPS诱导的Raw264.7细胞TLR4及炎症相关因子mRNA表达的影响为研究17β-E2对炎症反应的影响，通过qRT-PCR法检测Raw264.7细胞中TLR4、IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA表达水平。结果如图2显示，与Mock组相比，DMSO处理对细胞炎症因子的表达无明显影响。LPS诱导Raw264.7细胞后4 h，TLR4的mRNA水平显著提高(P<0.05)，IL-1β、IL-18、NLRP3 mRNA表达极显著提高(P<0.01)。与LPS组相比， E2+LPS共处理组TLR4、IL-1β 、IL-18和NLRP3 mRNA表达均降低，差异显著(P<0.05)。

与Mock组相比，*P<0.05，**P<0.01；与LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01。下同

2.3 17β-E2对LPS诱导Raw264.7细胞中IL-1β蛋白表达量的影响为验证17β-E2对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症反应的影响，首先向Raw264.7细胞中添加终浓度为250 nmol/L的雌激素受体抑制剂ICI 182 780孵育30 min，再依次加入17β-E2、LPS和ATP，分别收集细胞上清和沉淀，用WB和ELISA法检测各组IL-1β的表达情况。结果如图3所示，与Mock组相比，E2处理组IL-1β细胞上清和沉淀中蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)，LPS处理极显著提高IL-1β蛋白表达水平(P<0.01)。与LPS组相比，E2+LPS组细胞和上清中IL-1β蛋白表达量均下降，差异极显著(P<0.01)，而ICI 182 780+E2+LPS组细胞中IL-1β蛋白表达量与LPS组相比则无显著性差异(P>0.05)。

图3 17β-E2对LPS诱导Raw264.7细胞中IL-1β蛋白表达量的影响

2.4 17β-E2对LPS诱导Raw264.7细胞中p-IκBα和NF-κB p65表达的影响为进一步探究17β-E2抑制LPS引起的细胞炎症反应的分子机制，分别收集各组细胞沉淀抽提细胞核和细胞浆蛋白，用WB方法分别检测细胞核内NF-κB p65，细胞浆中NF-κB p65、p-IκBα和IκBα的蛋白表达情况。结果如图4所示，与Mock组相比，LPS处理极显著提高了细胞核中NF-κB p65的蛋白表达量(P<0.01)，E2处理细胞核中NF-κB p65表达量和细胞浆中p-IκBα水平均无明显变化(P>0.05)。与LPS组相比， E2+LPS组细胞核中NF-κB p65的蛋白表达量和细胞浆中p-IκBα水平均极显著下降(P<0.01)。

图4 17β-E2对LPS诱导Raw264.7细胞中p-IκBα和NF-κB p65表达的影响

2.5 17β-E2对LPS诱导的Raw264.7细胞内NF-κB p65表达量的变化为进一步探究17β-E2发挥抗炎作用的ER亚型，分别使用ERα和ERβ拮抗剂进行试验。首先向Raw264.7细胞中分别添加终浓度为250 nmol/L的ER抑制剂ICI 182 780，ERα的选择性拮抗剂MPP，ERβ的选择性拮抗剂PHTPP，孵育30 min，而后再依次加入17β-E2、LPS和ATP。用免疫荧光法观察NF-κB p65在细胞内的表达量和定位情况。结果如图5所示，与Mock组相比，LPS处理组NF-κB p65在细胞核内的表达量急剧升高，E2+LPS组p65多在细胞质内有表达，ICI182 780+E2+LPS组NF-κB p65在细胞核中的表达量再次升高，MPP+E2+LPS组NF-κB p65主要在细胞质中有表达，PHTPP+E2+LPS组NF-κB p65在细胞核中的表达量较高。

图5 17β-E2对LPS诱导的Raw264.7细胞内NF-κB p65表达量的变化(6 400×)

3 讨论

雌激素是主要是由卵巢的卵泡分泌的一种类固醇激素，主要包括雌酮、雌二醇和雌三醇等，其中雌二醇(17β-E2)的生物活性最强。除了促进雌性生殖系统生长发育外，雌激素还参与细胞的生长、分化、免疫应答和炎症反应等，还与自身免疫性疾病密切相关[17-21]。在人医领域，广泛采用雌激素联合甲硝唑治疗绝经后老年性阴道炎，疗效显著[22]。但截止目前，雌激素抗炎作用的具体机制尚不清楚[4]。本试验采用质量浓度1 000 μg/L的LPS作用Raw264.7细胞4 h，构建细胞炎症模型来探讨17β-E2对LPS诱导细胞炎症的保护作用。结果显示，从mRNA表达水平上看，与Mock组相比，LPS处理后细胞IL-1β、IL-18、NLRP3表达极显著提高(P<0.01)，TLR4表达提高(P<0.05)，与LPS组相比，E2+LPS处理组极显著抑制了IL-1β 、IL-18和NLRP3表达(P<0.01)，显著降低了TLR4表达(P<0.05)，这与张莉莉等[23]的研究结果一致。从蛋白表达水平上看，与Mock组相比，LPS处理极显著提高细胞内和细胞上清中IL-1β水平(P<0.01)，与LPS组相比，E2+LPS组细胞内和上清中IL-1β蛋白表达量均极显著下降(P<0.01)。而ICI 182 780+E2+LPS组细胞上清中IL-1β蛋白表达量提高(P<0.05)。结果表明17β-E2可抑制LPS引起的细胞炎症反应，而ICI 182 780又可以拮抗E2的炎症抑制反应，进一步验证了17β-E2的抗炎作用。

核因子kappa B(NF-κB)家族的转录因子是免疫发育、免疫反应、炎症和癌症的关键调节器[24-25]。NF-κB家族主要成员包括p65和p50，正常生理情况下，两者以异二聚体形式存在于细胞质中，当受到炎症等刺激因素时，NF-κB通路被激活，p65从细胞质转移至细胞核，进而促进促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放[26-28]。在本试验中，通过分离细胞核和细胞浆蛋白，用WB方法分别检测细胞核内NF-κB p65以及细胞浆中NF-κB p65、p-IκBα、IκBα的表达情况。结果显示，与Mock组相比，LPS处理极显著提高了细胞核中NF-κB p65的蛋白表达量(P<0.01)，与LPS处理组相比，E2+LPS组细胞核中NF-κB p65的蛋白表达量和细胞浆中IκBα的磷酸化水平均极显著下降(P<0.01)。

雌激素受体(ER)是雌激素作用的关键配体，其与雌激素结合后可调控下游靶基因的表达，其主要包括两种亚型ERα和ERβ[29]。研究显示，患有子宫内膜炎母犬和母马中，子宫腺中ER表达量均显著低于正常母犬和母马[4,30]。本试验分别通过添加ER、ERα和ERβ拮抗剂的方式，观察17β-E2对LPS诱导的Raw264.7细胞内NF-κB p65入核的变化。结果显示，LPS处理组NF-κB p65在细胞核内的表达量急剧升高，E2+LPS组p65多在细胞质内有表达，加入ERβ的选择性拮抗剂PHTPP后，p65在细胞核中的表达量较高，而加入ERα选择性拮抗剂MPP，p65仍主要在细胞质中表达。这表明雌激素主要通过与ERβ结合后，抑制NF-κB p65进入细胞核和抑制IκBα磷酸化的水平，从而抑制细胞炎症反应的发生。

综上所述，17β-E2对LPS诱导RAW264.7细胞炎症具有保护作用，其机制可能是通过与雌激素受体ERβ结合介导NF-κB 信号通路，进而抑制促炎因子IL-1β的表达，从而发挥抗炎作用。