犬骨骼血管肉瘤的影像学及病理形态学分析

高 蕊，张海涛，石俊超，张 竞，马 莹，徐荣艺，贺文琦，陆慧君*

(1.吉林大学 动物医学学院/人兽共患病研究所，吉林 长春 130062；2.吉林省辉南县农业农村局,吉林 通化 135100)

骨肿瘤是发生于骨的一种罕见的异质性肿瘤，人发生的骨肿瘤大多数为良性，极少数为恶性。恶性骨肿瘤称为骨癌，骨癌在所有癌症中占比不足1%，它可以发生在身体的任何一块骨头，但最常见于骨盆及四肢的长骨[1]。在犬类动物，骨的原发性肿瘤可能来源于骨组织、软骨、纤维组织、脂肪组织或血管组织。其中，骨和软骨来源的肿瘤最为常见。到目前为止，犬的原发性骨肿瘤在宠物中发病率最高，而且大多数是恶性的。犬恶性骨肿瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤和血管肉瘤等，在这些恶性肿瘤中，骨肉瘤占85%，软骨肉瘤约占骨原发肿瘤的10%，发病率仅次于骨肉瘤,骨脂肪肉瘤与纤维肉瘤在犬骨肿瘤中不常见[2]。

骨血管肉瘤(bone hemangiosarcoma,BHSA)是发生于人和动物的一种相对罕见的高侵袭性的原发性骨肿瘤，病死率高，通常预后不良，因此快速准确的诊断结果对于指导临床十分关键。而通常在临床影像学检查中，无法区分BHSA和骨肉瘤(osteosarcoma)，须通过病理组织学分析及免疫组织化学鉴别诊断进行确诊。本研究通过对临床贵宾犬病例进行影像学检查、临床肿瘤病理组织学特征观察及免疫组织化学鉴别诊断，确诊为犬骨血管肉瘤。研究结果为该病的临床治疗方案及预后评估提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 案例情况4岁龄雄性贵宾犬，已去势。左侧后肢肿胀，走路跛行，于2020年10月入院就诊。

1.2 试验材料及主要设备见表1。

表1 试验材料及主要设备

1.3 石蜡切片的制作及观察取3块样本组织置于10%福尔马林固定液中固定24 h；固定好的组织块纵切，置于包埋盒中；将组织块在不同梯度的乙醇溶液中脱水30 min，然后依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液各30 min；再分别放入3个65℃石蜡溶液中，40 min 后取出，放于包埋机中进行包埋；将石蜡块切成厚度为3、5 μm的薄片，置于42℃的水浴锅中，待切片展平后贴于载玻片上，放入烘箱中烤30 min；将3 μm的石蜡切片脱蜡，复水，苏木素、伊红染色后，经梯度酒精脱水二甲苯透明后，滴加中性树胶封片，自然晾干24 h。

1.4 免疫组织化学染色将5 μm的切片脱蜡水化，自来水漂洗2次，进行抗原修复，在组织区域加入内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS溶液冲洗；加入羊非免血清室温孵育10 min，PBS溶液冲洗；加一抗孵育(表2)，PBS溶液冲洗3次；加入生物素标记的羊抗鼠抗体，室温孵育10 min，PBS溶液冲洗3次，加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS溶液冲洗3次，DAB显色，待有阳性信号出现，入水终止显色。入苏木素复染，脱水，封片。

表2 一抗使用条件

2 结果

2.1 影像学检查结果膝关节间隙不对称， 侧股骨远端骨质破坏呈虫蚀样改变，内侧骨皮质消失，骨膜新骨形成，远端骨皮质不连续(图1)。

A.骨盆腹脊位，膝关节间隙不对称；B.腿部侧位，侧股骨远端，骨质破坏呈虫蚀样改变，内侧骨皮质消失，骨膜新骨形成，远端骨皮质不连续； C.骨盆侧位

2.2 大体病变检查结果送检组织块为左侧后肢采样骨组织和骨髓，共3块，肉眼观察组织块颜色呈暗红色，无包膜包被，直径均小于2 cm，切面呈暗红色，质地坚实(图2)，其大小分别为2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm和0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。

A.送检组织表面呈暗红色，无包膜包被，直径均小于2 cm；B.切面呈暗红色，质地坚实

2.3 病理组织学检查结果送检组织块具有相似的病理组织学变化。低倍镜下，大部分正常骨组织结构已经消失(图3A)，剩下一些残存的骨小梁及软骨组织(图3B)，骨髓腔及周围骨组织被大量杂乱生长的肿瘤细胞所代替，并侵犯临近软组织(图3C)。同时，肿物区域及周围伴有大面积出血(图3D)。高倍镜下，肿瘤细胞或致密排列或形成管腔结构，管腔内部充满红细胞(图3E)。肿瘤细胞主要呈梭状或不规则状，细胞边界不清晰，细胞质嗜酸性染色，并可见明显的核仁(图3F)，偶有双核及多核细胞出现(图3G，箭头所指)，有丝分裂较为常见(图3H，箭头所指)。

2.3 免疫组织化学染色结果免疫组织化学结果显示，肿瘤细胞质Factor Ⅷ、CD31均呈强阳性染色，说明该肿瘤为血管内皮细胞来源(图4)。

A.正常骨组织结构消失； B.残存的骨小梁及软骨组织；C.骨髓腔内外组织被大量杂乱生长的肿瘤细胞所代替，且临近软组织也被肿瘤细胞侵犯； D.大面积出血区域；E.肿瘤细胞或致密排列或形成管腔结构，管腔内部充满红细胞；F.肿瘤细胞形态各异，大小不一，主要呈梭状或不规则状，并可见明显的核仁；G.双核及多核细胞出现；H.偶见有丝分裂

2.4 综合诊断临床影像学检查显示左后肢膝关节间隙不对称，未见明显软组织肿大；侧股骨远端骨质破坏呈虫蚀样改变，内侧骨皮质消失，骨膜新骨形成，远端骨皮质不连续;病理组织学检查显示浸润的肿瘤细胞中有多个大小不一的血管间隙，故初步诊断为血管肉瘤；进一步利用血管内皮标记物Factor Ⅷ和CD31进行免疫组织化学染色，显示两种染色肿瘤细胞均呈阳性。因此，该病例经临床检查、病理组织学观察以及免疫组织化学染色，确诊为骨血管肉瘤。

A.Factor Ⅷ呈胞浆染色；B.CD31为血管内皮染色

3 讨论

血管肉瘤是起源于血管内皮细胞的恶性间充质肿瘤，在犬发病率最高，患病率在0.30%～1.98%之间。血管肉瘤可在任何组织中出现，几乎影响所有犬种，在大中型犬中最为常见，德国牧羊犬、金毛猎犬、拉布拉多猎犬和雪纳瑞犬等多发[3]。在骨组织中，血管肉瘤最常发生的部位是胫骨近端或远端、桡骨、股骨和肱骨。BHSA患犬年龄范围较广，平均年龄为6岁，且雄性犬易发病[4]。该肿瘤具有侵袭性，可引起疼痛、跛行、软组织肿胀和骨破坏等临床症状，极易出现病理性骨折[2]。

在本病例研究中，1例4岁龄雄性贵宾犬，消瘦、左后肢关节部肿胀、跛行，通过影像学检查发现患犬的左后肢膝关节间隙不对称，侧股骨远端骨质破坏呈虫蚀样改变，内侧骨皮质消失，骨膜新骨形成，远端骨皮质不连续，这是导致犬后肢肿胀和跛行的原因。根据临床检查结果，临床医生怀疑该犬患有骨癌，进而对患部骨组织及骨髓取样进行病理组织学检查。肉眼观察送检组织块表面及切面呈暗红色，提示有出血，该病变与镜下观察到的大面积出血相吻合。通过病理组织学观察，发现患犬正常骨组织结构被破坏，骨髓腔内及骨组织中有大量异常增殖的肿瘤细胞浸润生长。肿瘤细胞形态各异，大小不一，呈梭形或多边形，肿瘤细胞排列呈两种形式：部分呈致密、实性排列；部分呈管腔状排列，且管腔内有红细胞存在。同时，肿瘤细胞有丝分裂较常见。根据这些特征，判断该肿瘤细胞为血管内皮细胞来源，通过HE 染色结果初步诊断为骨血管肉瘤。

肿瘤鉴别诊断常用的方法是免疫组织化学染色。抗原在组织切片中被特异性抗体识别，通过抗原抗体结合及显色反应，显示细胞或组织中的化学成分，然后利用显微镜进行观察。现常用CD31和Factor Ⅷ作为HSA的特异性标记物。CD31又称血小板-内皮细胞黏附分子-1，是一种跨膜糖蛋白[5]。CD31分子通常表达于血管内皮细胞、血小板、巨噬细胞、中性粒细胞以及部分淋巴细胞亚群表面。在内皮细胞连接处表达量最高[6]。在免疫组化中，CD31可用于证明内皮细胞组织的存在，用于评估肿瘤血管生成，证明血管瘤和血管肉瘤。具有较强的特异性和灵敏性。Factor Ⅷ相关抗原亦可作为血管肉瘤的特异性标记物，其存在于内皮细胞和巨核细胞中，Factor Ⅷ相关抗原(vWF)是血管肉瘤和淋巴管肉瘤中内皮细胞分化的一个非常特殊的标记，但是在恶性程度极高的血管肉瘤中敏感性低[1,7]。因此，为进一步确诊，联合使用血管内皮细胞特异性标记物CD31及Factor Ⅷ对该肿瘤进行组织化学染色，两者均呈阳性表达，表明肿物为血管内皮来源。最终，该病例经临床检查、病理组织学分析以及免疫组织化学综合诊断，确诊为BHSA。目前，国内尚未见有犬BHSA病例报道，本研究首次报道了贵宾犬患骨血管肉瘤的病例，为动物临床肿瘤性疾病的诊断提供参考资料。

JEONGHYEON等[4]在2020年报道了1例患有原发性BHSA的4岁龄哈士奇犬，病理组织学观察看到肿瘤细胞几乎完全浸润于远端指骨，轻度浸润于中端趾骨，并侵犯邻近软组织。增生的肿瘤细胞呈梭形，且有明显的出血，血管内皮细胞特异性标记物CD31呈弥漫性强阳性，Factor Ⅷ出现散在染色，此报道与本病例中所观察到的病理组织学有相似特征。然而，由于缺乏对该贵宾犬肝、脾、肺或心脏等器官的相关临床信息，所以无法确定该贵宾犬所患的BHSA是否为原发性。通常，BHSA在出现临床症状前可破坏大面积的骨组织[3]，这时大多数肿瘤已经通过血液转移到其他部位，肺脏是最常见转移部位，但本病例术后并未对肺脏，血液进行进一步的检查，因此，也无法确定肿瘤是否转移。

目前，手术仍是治疗犬BHSA的主要方式，截肢术已经在许多BHSA病例中使用，但是对提高存活时间效果有限，极少的患犬在术后可存活6～8个月；由于手术的局限性，化疗已经发展为治疗BHSA的重要辅助手段，常用的药物包括长春新碱、环磷酰胺等[4]。除化疗外，术后支持性药物有头孢菌素类抗生素、曲马多、西咪替丁、阿霉素等[1,3,7-8]。目前关于BHSA也有一些新的治疗方法，如吸入化疗、生物反应调节剂与化疗联合使用等。

在人类医学方面，BHSA占原发性骨肿瘤的0.23%、占恶性骨肿瘤的0.43%，男性较多见，50%的病例发生在头颈部的皮肤和软组织处，其次为骨盆、四肢长管状骨[9-10]。人BHSA常表现为运动障碍，局部出现疼痛与肿胀[11-13]。病理组织学特征为分化良好的肿瘤细胞可形成血管结构，分化较差的肿瘤细胞常伴有明显的出血和坏死[14-15]。这与犬BHSA有相似的临床症状及病理组织学变化。由于犬恶性肿瘤与人的大多数恶性肿瘤(如非霍奇金淋巴瘤、骨血管肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌等)具有很多相似的特点，包括病理组织形态、肿瘤遗传学、肿瘤的生物学行为以及对治疗的反应等。因此，本研究结果也可为人类肿瘤的研究提供一定的参考价值。

(感谢台湾大学兽医学院刘振轩教授协助诊断及对文稿的指导意见)