一种秦岭羚牛肺线虫新种——羚牛变圆线虫的鉴定

王俊伟，潘广林，郭庆彬，黄 爽，陈金铭，杨 新，宋军科*，赵光辉*

(1.西北农林科技大学 动物医学学院，陕西 杨凌 712100；2.秦岭大熊猫研究中心/陕西省珍稀野生动物救护基地，陕西 周至 710402)

肺线虫是一种寄生于人和动物肺脏及支气管等呼吸系统的线虫，其感染不仅会造成宿主咳嗽、呼吸困难，还可继发细菌感染，导致支气管肺炎、间质性肺炎等[1]。秦岭羚牛又称金毛扭角羚，主要分布于秦岭山脉西部地区，与四川羚牛同属于我国特有珍稀物种[2]。成年秦岭羚牛毛色呈白色或金白色，极具观赏价值，但由于其大多生存于野外环境，对其疾病的情况了解较少，防控经验不足，使得秦岭羚牛的生存状况较为艰难。

2019年3月，在陕西省周至县楼观台地区发现了1头野生羚牛死亡，经剖检发现其肺部有大量线虫寄生。为明确这些肺部线虫的种类，本研究对该头秦岭羚牛的肺线虫进行了采集和固定，并综合应用传统形态学和分子生物学方法对获得线虫进行了种属鉴定，研究结果为秦岭羚牛肺线虫病的流行病学调查和防控提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 虫体样品利用蠕虫完全剖检法[3]采集陕西省周至县楼观台地区发现的1头死亡羚牛肺脏内寄生的线虫。将死亡羚牛的胸腔剖开后，取出肺脏，用手术剪沿支气管将肺脏剪开，利用挑虫针挑取其中寄生的线虫，直接放入70%乙醇，冲洗干净，标记宿主品种、采样时间、地点和年龄等信息，将虫体样本保存于4℃备用。

1.2 主要试剂与仪器苯酚、乳酸、甘油均购自天津市致远化学试剂有限公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、大肠杆菌JM109感受态细胞、DL2000 DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司；2×Es Taq MasterMix购自赛默飞世尔科技公司；TIANamp Genomic DNA Kit、Universal DNA Purification Kit均购自北京天根生化科技有限公司；光学显微镜购自尼康仪器有限公司；DYY-31A型稳压稳流电泳仪购自北京六一厂；PCR扩增仪购自杭州博日科技有限公司；紫外凝胶成像仪ChampGei5000购自赛智创业科技有限公司。

1.3 虫体形态学指标的测定和种属初步鉴定首先观察虫体肉眼观的形态特点，再将虫体放入乳酚透明液中透明处理3～5 min，在显微镜下用测微尺测量并记录虫体的长度、宽度，以及口囊、食道、雌虫阴门、雄虫交合伞等形态特征，按文献[3-4]方法进行种属鉴定。

1.4 虫体基因组DNA的提取选取15条虫体进行基因组DNA的提取，包括13条雌虫(命名为BL1900101、BL190A102、BL190B202、BL190C301、BL190D101、BL190D201、BL190D405、BL190E501、BL190F601、BL190G201、BL190H101、BL190I101和BL190J204)和2条雄虫(命名为BL190M304和BL190M401)。虫体样本经无菌双蒸水洗涤后用蛋白酶K过夜处理，次日使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒按照说明书提取每条虫体的基因组DNA。

1.5 虫体ITS-2 rRNA基因的PCR扩增、电泳、克隆和测序PCR扩增采用文献[5]设计的1对通用引物(NC1：5′-ACGTCTGGTTCAGGGTTGTT-3′；NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。扩增体系为25 μL，包括11 μL 2×Es Taq Mastermix、上下游引物(20 μmol/L)各1 μL和1 μL虫体基因组DNA，反应条件为：95℃ 5 min;95℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s进行30个循环;72℃延伸7 min。

利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，将正确的PCR扩增产物使用Universal DNA Purification Kit试剂盒按照操作步骤纯化，纯化产物连接至pMDTM19-T载体构建重组质粒，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，利用上述引物进行PCR鉴定，阳性菌液样品送上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。

1.6 序列分析测得序列使用NCBI BLAST进行同源性比对，对照测序图谱进行序列校准，去除两翼5.8S rRNA和28S rRNA序列，获得的ITS-2基因全序列利用Megalign进行同源性分析，利用Mega X软件使用邻近法构建系统发育进化树，以Kimura 2-parameter为模型，自展值设为2 000，以捻转血矛线虫(LC360163)为外群。

2 结果

2.1 秦岭羚牛源肺线虫的形态学特征本研究共采集到214份虫体样本，均为成虫。肉眼观下呈淡黄色、丝状。显微镜下观察发现，头端较为钝圆、粗大；口端有3个唇片(图1A)，食道呈棒状，后端膨大，神经环位于食道前1/2处(图1B)。

雄虫长30.500～31.200 mm，口囊大小为0.025 mm，食道长0.350 mm；尾端有1对翼膜，无横纹或纵纹；交合伞较小，大小为0.095 mm×0.065 mm，侧肋较为粗短，中侧肋到达伞缘，其余侧肋较短；交合刺1对且不等长，呈褐色，长0.210～0.241 mm(图1C)。

雌虫长为36.500～41.600 mm，口囊大小为0.023～0.047 mm，食道长0.360～0.420 mm，肛门距尾尖的距离为0.040～0.057 mm，阴门距尾尖的距离为0.088～0.112 mm。尾端尖锐呈圆锥形，末端有颗粒状物质，阴门盖形态多样，有扇状、双瓣状、半圆状等(图2)，大小为(0.120～0.150) mm×(0.055～0.070) mm。与其他已报道变圆属线虫的形态学数据分析见表1。

表1 变圆属线虫的形态学比较 mm

A.头端(400×)；B.头端(100×)；C.雄虫尾端结构(400×)

A.扇状(400×)；B.两瓣状(400×)；C.半圆状(400×)

2.2 秦岭羚牛源肺线虫ITS-2 rRNA基因的序列特征及种系发育关系分析结果以虫体组织DNA作为PCR模板进行扩增，15条虫体的ITS-2 rRNA基因的扩增条带均约为500 bp，与预期大小一致(图3)。序列分析发现，本研究所获得肺线虫的ITS-2 rRNA基因全长为409～431 bp，序列与GenBankTM发表的原圆科变圆属线虫Varestrongyluscf.capreoli(KJ452176)相似性最高，为80.35%～82.30%。利用Megalign进行序列分析发现(图4)，本研究中的15条秦岭羚牛肺线虫ITS-2 rRNA基因序列相似性为97.5%～100.0%。种系发育关系分析发现(图5)，本研究获得的秦岭羚牛肺线虫样本单独位于一支，与原圆科变圆属线虫(KJ439597、KJ439598)位于姊妹支，但ITS-2 rRNA基因序列之间的差异较大，为24.1%～25.4%。

M.DL2000 DNA Marker；1～15.秦岭羚牛肺线虫样本 BL1900101、BL190A102、BL190B202、BL190C301、BL190D101、BL190D201、BL190D405、BL190E501、BL190F601、BL190G201、BL190H101、BL190I101、BL190J204、BL190M304、BL190M401；16.阴性对照

图4 肺线虫ITS-2 rRNA基因序列的同源性分析结果

▲ 秦岭羚牛肺线虫样本序列

3 讨论

国内研究发现，羚牛体内外寄生虫的感染强度较大[6-7]，尤其以网尾科线虫和原圆科线虫为主的肺线虫感染率最高[8-9]。向丕元等[9]研究了四川地区不同年龄野生羚牛寄生虫的感染情况，发现原圆线虫为优势虫种。杨光友等[10]采集了四川蜂桶寨自然保护区63头野生羚牛的新鲜粪样，肺线虫幼虫的检出率高达79.37%。

目前，对于羚牛肺线虫的种属鉴定主要基于形态学特征，如头部、食道类型、尾部结构等[11-12]。已报道的6种可寄生于羚牛呼吸系统的肺线虫，包括胎生网尾线虫、鹿网尾线虫、长刺变圆线虫、天全三叉圆线虫、羚牛圆线虫和柯氏原圆线虫[13]。本研究通过形态学观察发现，寄生于该头死亡秦岭羚牛肺部的线虫符合原圆科变圆属线虫的典型结构，如口有3个唇片、食道呈棒状等，与其他已报道变圆属线虫的形态学数据相似。但本研究所采集雌虫的尾部阴门盖形态特征明显与其他变圆属线虫不同，本研究中的雌虫均具有阴门盖结构，且较为发达，形状多样(呈扇状、双瓣状、半圆状)，而绝大多数已报道的变圆属线虫雌虫的阴门盖不发达或不具有阴门盖结构。此外，本研究获得的虫体形态与刘世修[14]在羚牛体内发现的长刺变圆线虫较为相似，但雌雄虫生殖结构明显不同，推测本研究中的线虫可能为原圆科变圆属的新种。

传统形态学方法虽然具有方便、易行等优点，但线虫的形态学检查结果可能会受到检查者的主观影响，且有时不能有效用于近缘种、幼虫阶段虫体等的鉴定。近年来，分子生物学方法在寄生虫的鉴定和分类研究中被证实更高效、准确，已被广泛地运用于多种寄生虫感染的分子流行病学调查和种群结构分析[15-17]。分子生物学方法不仅可以从基因层面分析种群内部差异，还可基于系统发育分析推断寄生虫可能的进化演变规律。众多研究表明，线虫的核糖体DNA中的内转录间隔区的种间变异性较大，而种内又具有高度保守性，适用于原虫、蠕虫等寄生虫的分类及种类鉴定[18]。EPE等[19]利用基于ITS-2 rRNA基因的分子生物技术研究了网尾科线虫的种间差异，证明了利用ITS rRNA基因序列的生物学技术对肺线虫进行种类鉴别的可行性；KUCHBOEV等[20]通过对乌兹别克斯坦5种山羊原圆线虫的研究发现，ITS-2 rRNA基因序列之间的差异足以进行物种鉴定，为山羊原圆线虫的种类鉴定及进一步分类提供了基础数据。本研究对秦岭羚牛肺线虫的ITS-2 rRNA基因进行序列分析发现，BLAST比对与原圆科变圆属线虫Varestrongylus.cf.capreoli(KJ452176)的相似度最高(80.35%～82.30%)，而本研究的虫体样本的ITS-2 rRNA基因序列的相似性很高(97.5%～100.0%)；进一步基于ITS-2 rRNA基因序列的系统发育分析发现本研究所获得的虫体样本单独位于一支，与原圆科变圆属线虫(KJ439597，KJ439598)位于姊妹支，但两者的ITS-2 rRNA基因序列差异很大(24.1%～25.4%)。基于形态学特征和分子生物学鉴定结果，推测本研究获得的秦岭羚牛肺线虫应为原圆科变圆属线虫的一个新种，我们暂时将其命名为羚牛变圆线虫。

原圆科线虫为生物源性寄生虫，其发育需要陆地螺或蛞蝓作为中间宿主，虫卵由雌虫在肺部产出后，迅速发育孵化为第1期幼虫，沿着细支气管到达口腔，再进入肠道，之后随粪便排出体外[3,21]。向丕元等[8]研究发现，外界环境中的幼虫只有从软体动物的肉足褶壁处侵入才可在肉足肌肉组织中停留寄生，并在15～25℃经2次蜕皮后发育为感染性幼虫。当反刍动物摄入感染性幼虫后，幼虫钻入宿主肠壁，在肠系膜淋巴结内进行蜕皮后移行至肺，在肺泡、细支气管或肺实质中发育为成虫[22]。目前已报道的原圆科变圆属线虫有肺变圆线虫(Varestrongyluspneumonicus)、长刺变圆线虫、舒氏变圆线虫(Varestrongylusschulzi)和青海变圆线虫(Varestrongylusqinghaiensis)[4]，但均未对其生活史进行相关研究。本研究对获得肺部线虫观察未发现其他发育阶段虫体，不确定其生活史是否完全符合原圆科线虫的特征。因此，未来从生活史的角度对变圆线虫进行研究，将更能有助于确定其种属和进行相关防控策略的制定。