常用芸香科柑桔属药材特征图谱鉴别研究

杨晓东，曹斯琼，何广铭，周湘媛，吴辉强，邓 韬，李国卫

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

枳实、枳壳、个青皮、四花青皮、陈皮、化橘红均为芸香科（Rutaceae）柑桔属CitrusL.临床常用中药。枳实（酸橙）、枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种不同成熟度的果实[1]，个青皮、四花青皮、陈皮为芸香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培变种的不同成熟度的果实或果皮[1]，化橘红（柚）为芸香科植物柚C.grandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮[1]。因其属于同科同属药材，具有理气健脾、化痰等相似功效[2]，且化学成分也以橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等黄酮类成分为主[3]，有较高的相似性，在价格波动较大的情况下，常有掺杂或替代使用的情况出现。《中国药典》2020年版中6种药材均有各自成分的相关检测方法，包括薄层鉴别和含量测定，但从提取方法到色谱条件各种药材的测定方法均有差异，当鉴定一个未知样品时，如药材粉末或配方颗粒，需要反复实验，鉴定过程繁琐复杂。虽然6种药材均有指纹图谱等相关文献报道[4-7]，但未在相同的条件下对其指纹图谱进行对比研究，鉴别过程同样复杂繁琐。因此，本实验将对上述6种药材进行特征图谱研究，通过特征图谱和相似度的比较，达到既可以鉴别药材品种，又可以区分不同成熟度药材的目的。

化学计量学方法已被广泛应用于中药材鉴别和中药材产地分析，他基于数学、化学、统计学及计算机科学的方法及原理，设计并优化实验、处理并分析检测数据信息，从而获取复杂分析体系中隐含的信息[8]。普遍应用的有主成分分析、聚类分析及偏最小二乘判别分析（orthogonal partialLeast aquaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）等。聚类分析是按样品品质特性的相似性使其成对逐渐聚合在一起，相似性较高的样品优先聚合在一起，从而完成聚类分析的过程[9]。通过聚类分析将6种药材按相似性进行聚类，达到区分橘、柚、橙3大类药材的目的，并通过主成分分析进行佐证。通过OPLS-DA法进一步区分橘不同成熟度的果实或果皮。通过上述几种方法对常用柑桔属药材进行分类和质量评价，为柑桔属药材的鉴定与质量控制提供参考。

1 仪器与材料

Waters ARC型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Waters Xselect HSS T3型（250 mm×4.6 mm，5 μm）；ME204E型万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；XP26型百万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500D型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Direct型超纯水系统（美国默克股公司）。甲醇为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

对照品新橙皮苷（批号111857-201804，质量分数为99.40%）、柚皮苷（批号110722-201714，质量分数为93.40%）、橙皮苷（批号110721-201818，质量分数为96.20%）均由中国食品药品检定研究院提供；对照品川陈皮素（批号18070602，质量分数为98%）、橘皮素（批号18031501，质量分数为98%）均由成都普菲德生物技术有限公司提供；芸香柚皮苷（批号wkq19041908，质量分数98.0%）、水合橙皮内酯（批号wkq20031904，质量分数为98.0%）均由四川省维克奇生物科技有限公司提供。实验所用药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，ZS1～ZS15号样品芸香科植物酸橙C.aurantiumL.及其栽培变种的干燥幼果、ZQ1～ZQ15号样品为芸香科植物酸橙C.aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实、GQ1～ZQ13号样品为芸香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果、SH1～SH14号样品为芸香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培变种的干燥未成熟果实的果皮、CP1～CP14号样品为芸香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮、HJ1～HJ13号样品为芸香科植物化州柚C.sgrandis‘Tomentosa’的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，见表1。

表1 84批样品信息Table 1 84 batches of sample information

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，洗脱程序为0～30 min，15%～30% A；30～50 min，30%～60% A；50～55 min，60%～85% A；55～60 min，85% A；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10 μL；检测波长为284 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、川陈皮素、橘皮素对照品适量，加甲醇制成62.700、57.675、51.275、56.012、1.034、57.771、55.174 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品细粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定质量，补充质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱方法学研究

2.4.1 精密度试验 分别取同一份个青皮（批号GQ1）和枳实（批号ZS1）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。计算各自共有色谱峰的保留时间与峰面积RSD，结果均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 分别取同一份个青皮（批号GQ1）和枳实（批号ZS1）供试品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 6个时间点按“2.1”项色谱条件进样测定。计算各自共有色谱峰的保留时间与峰面积RSD，结果均小于2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 分别取个青皮（批号GQ1）、枳实（批号ZS1）平行制备6份供试品溶液，进样测定。以橙皮苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明此方法重复性良好。

2.5 特征图谱分析及评价

2.5.1 特征图谱的建立及共有峰归属 取15批枳实、15批枳壳、13批个青皮、14批四花青皮、14批陈皮、13批化橘红药材样品，各约0.5 g，精密称定，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，将色谱信息导入中药色谱指纹图谱相似度软件进行分析：枳实确定11个共有峰，枳壳确定10共有峰，个青皮共确定11个共有峰，四花青皮确定10个共有峰，陈皮确定9个共有峰，化橘红确定6个共有峰，6种药材特征图谱共有峰见图1。6种药材的共有峰中4号峰（橙皮苷）分离度较好，响应较高，为药材中抗炎、抗氧化、抗菌、保护心血管系统的主要成分之一[10-11]，故以4号峰（橙皮苷）为参照峰（S峰）。经与对照品色谱峰保留时间相比对和DAD光谱分析。共指认出7个特征峰，分别为2号峰芸香柚皮苷、3号峰柚皮苷、4号峰橙皮苷、5号峰新橙皮苷、6号峰水合橙皮内酯、14号峰川陈皮素、15号峰橘皮素（图2）。

图1 6种药材HPLC特征图谱共有峰Fig.1 Common peaks in HPLC characteristic chromatograms of six medicinal materials

图2 6种药材样品共有峰对照品归属Fig.2 Ascription of common peak reference substances in six kinds of medicinal materials samples

枳实药材中主要成分为新橙皮苷，其次为柚皮苷[12]；枳壳中则是柚皮苷含量占主导地位[13]；个青皮、四花青皮、陈皮中黄酮类成分主要为橙皮苷[14]；化红药材中柚皮苷的含量占绝对主导地位。由特征图谱可知橙比橘多1、3（柚皮苷）、5（新橙皮苷）、6（水合橙皮内酯）和9号峰，橙比橘少7、8、10、13和16号峰；枳实比枳壳多11号峰；陈皮比个青皮少7、11号峰，四花青皮比个青皮少11号峰；化橘红的色谱峰最少。通过特征图谱色谱峰数量能明显区分上述6种药材。

“相似度评价系统”分别对ZS1～ZS15、ZQ1～ZQ15、GQ1～GQ13、SH1～SH14、CP1～CP14、HJ1～HJ13共84批药材样品HPLC特征图谱进行数据分析，峰4（橙皮苷）为参照峰，采用平均数，时间窗口为0.2，自动匹配，分别以枳实、枳壳、个青皮、四花青皮、陈皮、化橘红共有模式作为对照特征图谱，计算相似度系数，15批枳实药材的相似度均在0.935以上，15批枳壳药材的相似度均在0.926以上，13批个青皮药材的相似度均在0.959以上，14批四花青皮药材相似度均在0.864在上，14批陈皮药材的相似度均在0.937以上，13批化橘红药材的相似度均在0.999以上（表2），结果表明，同一品种间的相似度较大。以枳实、枳壳、个青皮、四花青皮、陈皮、化橘红的对照特征图谱2组之间分别进行相似度比较（表3）。由结果可知，6种芸香科药材对照特征图谱两组之间的相似度范围为0.008～0.990，表明6种药材间特征图谱差异性较大。

表2 6种不同品种药材样品相似度评价结果Table 2 Similarity evaluation results of six kinds of medicinal materials

表3 6种不同品种药材对照特征图谱相似度评价结果Table 3 Similarity evaluation results of characteristic chromatograms of six different varieties of medicinal materials

2.5.2 聚类分析 运用SPSS 20.0软件对84批药材16个共有峰的相对峰面积为数据进行聚类分析，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，结果见图3，当判断距离为20时，结果显示84批药材被分为3类。I类包括GQ1～GQ13、SH1～SH14、CP1～CP14，II类包括ZS1～ZS15、ZQ1～ZQ15，III类包括HJ1～HJ13，即橘不同成熟期的果实（个青皮、四花青皮、陈皮）归为一类，橙（酸橙）不同成熟期的果实（枳实、枳壳）归为一类，柚的果实（化橘红）归为另外一类；当判断距离为10时，ZS1～ZS15聚为一类，ZQ1～ZQ15聚为一类，HJ1～HJ13聚为另一类，即能将枳实、枳壳、化橘红各单独的聚为一类，个青皮、四花青皮、陈皮无法通过聚类分析进行划分。

图3 聚类分析结果Fig.3 Result of cluster analysis

2.5.3 主成分分析 以84批样品16个共有峰的相对峰面积为数据，用SPSS 20.0软件对其进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值和方差，见表4，碎石图见图4。结果显示前4个主成分的累积方差贡献率达87.347%，故选择成分1、2、3和4作为第1、2、3和4主成分，可代表柑桔属枳实、枳壳、个青皮、四花青皮、陈皮和化橘红6种药材特征图谱共有峰的大部分信息。由碎石图可知其特征值的变化情况，特征曲线有明显拐点，说明前4个主成分代表了6种芸香科柑桔属药材间的异同。初始因子载荷矩阵（表5），由结果可知，第1主成分主要体现色谱峰7、13、14、15（橘皮素）和16的信息，第2主成分主要体现色谱峰9的信息，第3主成分主要反映了峰3（柚皮苷）、11和12的信息，第4主成分主要反映了峰1和峰5（新橙皮苷）的信息，故4个主成分可表示特征图谱的主要信息。计算各样品之间的主成分得分（表6），不同的品种之间主成分得分差异较大，如枳实的主成分4得分最高；枳壳的主成分2得分最高；个青皮、四花青皮、陈皮的主成分1得分较高；化橘红的主成分3得分最高。不同品种的主成分得分存在较大差异。

表4 主成分特征值及方差Table 4 Analysis of principal components and variance

表5 主要因子载荷矩阵Table 5 Main factor loading matrix

表6 主成分得分、综合得分Table 6 Principal component score, sorting meter of comprehensive score

图4 碎石图Fig.4 Stone map

2.5.4 OPLS-DA 以个青皮、四花青皮、陈皮特征图谱的10个色谱峰相对峰面积为变量对3种药材进行OPLS-DA分析。所建立的模型，R2X（cum）＝0.909，R2X（cum）＝0.817，Q2（cum）＝0.783，均大于0.5，说明该模型稳定可靠，由图5可知，该模型可将不同成熟期橘的果实个青皮、四花青皮、陈皮样品分为3类，并从10个变量的VIP值图（图6）可知，以VIP＞1.0为显著影响，共找到5个差异标志物，其影响显著性排序为峰11＞峰10＞峰7＞峰8＞峰12，提示这几个化学成分对于区分不同成熟期橘的果实个青皮、四花青皮、陈皮贡献率较大。通过聚类分析能将橙、橘、柚3大类药材单独的聚为一类。能较好的区分不同成熟期橙的果实，但无法区分不同成熟期橘的果实，个青皮、四花青皮、陈皮每一类都存在着相互混淆的情况；其原因可能为芸香科橘采摘期较难控制，如个青皮GQ4、GQ12、GQ1、GQ6被聚类到陈皮类，推测上述4批个青皮可能为接近成熟或成熟橘脱落的果实，通过观察上述4批个青皮的药材性状时发现其果实较大，果皮颜色偏浅黄色，进一步验证了上述推测。四花青皮SH6、SH14、SH7、SH13和陈皮CP4、CP6、CP5、CP7、CP10、CP1被聚为一类，原因可能为这10批样品的成熟度接近，或因为橘的栽培变种较多，这10批样品属于某个变种的果实。由主成分分析可知，不同品种之间的主成分得分存在差异，如枳实的主成分4得分最高，而峰1和峰5（新橙皮苷）对主成分4的贡献率最大，由此推断峰1和峰5（新橙皮苷）是影响枳实与其他芸香科药材区分的主要因素。同理推测峰9是影响枳壳与其他芸香科药材区分的主要因素；峰7、13、14（川陈皮素）、15（橘皮素）、16是影响橘（个青皮、四花青皮、陈皮）与其他芸香科药材区分的主要因素；峰3（柚皮苷）、11、12是影响化橘红与其他芸香科药材区分的主要因素。通过OPLS-DA单独分析不同成熟期橘的果实时，能将个青皮、四花青皮和陈皮明显的区分出来。综上所述，不同芸香科药材间存在一定的差异。

图5 个青皮、四花青皮和陈皮的OPLS-DA分析Scores图Fig.5 Scores diagram of OPLS-DA analysis of Fructus citri immaturus, Pericarpium Citri Reticulatae and Tangerine peel

图6 10个色谱峰的OPLS-DA分析VIP图Fig.6 VIP values of 10 chromatographic peaks by OPLS-DA analysis

3 讨论

黄酮类成分作为芸香科柑桔属药材中的活性成分，枳实中主要成分为新橙皮苷，枳壳中柚皮苷的含量最高，化橘红药材中柚皮苷的含量占绝对主导地位，青皮与陈皮药材中橙皮苷的含量都为最高。不同柑桔属药材中黄酮类成分含量及种类均有显著性差异，且随着成熟度的增加，黄酮类成分的总量呈下降趋势[15-16]。临床药效表明陈皮的理气作用弱于青皮，枳壳的理气作用弱于枳实。其原因可能与黄酮类成分的含量下降有关。

本研究建立的HPLC特征图谱方法较全面地反映了芸香科柑橘属药材的化学成分，分析方法简便、准确可靠，利用聚类分析和OPLS-DA可以准确的区分上述芸香科柑橘属6种药材，为芸香科药材资源的进一步研究提供了依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突