注射用头孢硫脒杂质谱分析及质量控制

崇小萌 田冶 刘颖 姚尚辰 尹利辉 许明哲

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

头孢硫脒是由我国自行研制并首先应用于临床的半合成头孢菌素[1]，作为第1代头孢菌素，头孢硫脒对革兰阳性菌作用较强，尤其对葡萄球菌和肠球菌具有很强的抗菌活性，临床应用较为广泛[2-3]。稳定性实验结果显示注射用头孢硫脒具有较好的化学稳定性及物理稳定性[4]。

头孢硫脒的合成路线主要有两种，第一种为以7-ACA为起始原料，在低温、碱性条件下与溴乙酰溴反应制得溴乙酰7-ACA，再与N,N'-二异丙基硫脲在三乙胺存在下制得，第二条是先由N,N'-二异丙基脲基-2-硫代乙酸盐酸盐与Vilsmeier试剂作用制得活性酯，再将活性酯与带有硅基保护基的7-ACA反应制得[5]。合成路线不同、生产工艺参数不同会导致终产品中所含有的杂质种类不同，因此通过分析产品中的杂质谱情况可初步判断生产厂家所采用的工艺路线及参数是否合理，对产品中杂质的分析与控制是质量控制的重点。药物杂质谱表征存在于药品中的所有已知杂质和未知杂质的种类和含量[6]，其与药物生产的工艺路线、原辅料属性、工艺参数等密切相关，目前在仿制药注册、原料药产地变更、补充申请药品注册标准等方面已被予以高度关注[7-9]。对头孢硫脒原料中部分杂质分析已有文献报道[10-11]，但对注射用头孢硫脒中杂质谱的系统分析尚未见文献报道，本文在对4个厂家10批头孢硫脒原料以及12个厂家143批注射用头孢硫脒的杂质进行分析的基础上，总结出注射用头孢硫脒特征杂质谱，并对各杂质进行了定性分析，探索杂质与生产工艺及关键质控点的相关性，为工艺路线、产品质量评价提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

头孢硫脒原料：4厂家10批；注射用头孢硫脒：12厂家143批。

十二水合磷酸氢二钠: 国药集团化学试剂有限公司，20130427，≥99.0%；一水合柠檬酸：国药集团化学试剂有限公司，20160108，≥99.8%；头孢硫脒对照品：中国食品药品检定研究院，130523-201203，99.0%。

2 检测方法

2.1 HPLC法测定有关物质

液相色谱仪：Agilent1200 infinity Series，工作站：Agilent OpenLab2.3。

色谱柱：Kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(取无水磷酸氢二钠2.76 g，柠檬酸1.29 g，加水溶解并稀释成1000 mL)-乙腈(86:14)。流速：1.0 mL/min；检测器：紫外PDA；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样器温度：4℃；进样体积：10 μL。

2.2 LC-MS方法确认杂质结构

2.2.1 采用柱切换HPLC-MS方法

3201 S1-2双元泵，3202 S1-2真空脱气机，3014 S1-2柱温箱，3012 S1-2柱切换系统，3133 S1-2自动进样器，以上来自SHISEIDO(Tokyo, Japan), Accela二极管阵列检测器(Thermo Fisher Scientific Inc.,Massachusetts, USA)；3200Q TRAP质谱仪(Applied Biosystems Inc., California, USA)；工作站为Analyst®软件(version 1.6.2)。

色谱柱为Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；切换阀：六通阀A和B；切换用定量环体积：500 μL；流动相：C相： 含有1%甲酸的水溶液；D相：乙腈-1%甲酸溶液；梯度洗脱[0 min(100%C～0 B)；5.5 min (100%C～0 D)；25 min(0 C～100%D)；30min (0 C～100%D)]。MS参数：ESI离子源，二级质谱扫描，扫描范围：100～1000Da；气帘气：20 L/h，电离电压：+5000 V；离子源温度：400.00℃；吹扫气1：60 L/h；吹扫气2：60 L/h；碰撞诱导解离：中等；解簇电压：+30.0 V；入口电压：+6.0 V；碰撞电源：+62.00 V；碰撞电压：35 V，出口电压：+3.00 V。

2.2.2 采用柱切换HPLC-MS方法

Thermal QExactive Focus高分辨质谱仪；Dionex U3000 双三元液相色谱仪。DIANOX P680A 二维液相色谱系统。

色谱柱为Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm,5 μm)；切换阀：六通阀A和B；切换用定量环体积：500 μL；流动相：C相： 含有1%甲酸的水溶液；D相：乙腈-1%甲酸溶液；梯度洗脱 [0 min(100%C～0 B)；5.5min(100%C～0 D)；25 min(0 C～100%D)；30 min (0 C～100%D)]。LC-MSn质谱方法：扫描电压(+)3000.0V，毛细管温度(+)350.0℃，鞘气(+)35L/h，辅助气(+)10.00L/h，最大喷雾电流(+)100.00，探针加热器温度(+)350.00℃，S-棱镜RF水平50.00，离子源为HESI，扫描范围：100～1000 Da；一级质谱方法：正离子模式，分辨率70000，二级质谱方法：分辨率17500；分离窗口：3.0m/z；(N)CE: 10V；缺省电荷状态：1。

2.3 粉末X-衍射测定原料晶型

Rigaku Smartlab粉末X-射线衍射仪。阳极靶:Cu；电压及电流：45 kV，200 mA；单色仪：Ni滤光片；检测器：D/teX Ultra 250一维阵列检测器；扫描范围：2θ＝3°～60°；扫描间隔：0.01°；扫描速度：8°/min；狭缝系统：Soller Slit：5.0°；IS：1/2°；ISL：10.0 mm；RS1：20.0 mm ；RS2：20.0 mm。制样方法：取供试品约100 mg，置载样玻璃片上，用玻璃板正压法制片。

2 结果与讨论

2.1 头孢硫脒原料有关物质分析

对4个厂家头孢硫脒原料进行分析，其典型色谱图如图1所示，由图中可知，头孢硫脒原料中共检出6种主要杂质，其中杂质1为各厂家最大单个杂质。每个厂家所含杂质种类不同，有2个厂家的原料不含杂质2和杂质5，只有1个厂家的原料含有杂质6。

2.2 注射用头孢硫脒有关物质分析

对12厂家143批注射用头孢硫脒有关物质进行HPLC分析，其典型色谱图如图2所示，全部样品中共检出6种主要杂质，与原料一致，可见注射用头孢硫脒中的主要杂质均来自原料，在制剂生产过程中并未引入新的杂质。其中，杂质1、杂质3和杂质4含量较高，杂质1为各厂家制剂中最大单个杂质；杂质2和杂质5的含量较低，样品中这两种杂质均小于0.1%，部分样品中不含有杂质2和杂质5。143批样品中仅有13批样品含有杂质6，且含量均小于0.1%，13批样品均来自同一厂家，但此厂家其余27批样品中未检出杂质6，造成此结果的原因可能是由于所采用的原料生产工艺不稳定。各杂质在样品中的含量分布见图3。

头孢硫脒原料及注射用头孢硫脒中均未检出中国药典中的杂质C(头孢硫脒酰化物Ⅰ)即溴乙酰-7-ACA(含量低于0.05%)，杂质C为头孢硫脒合成过程中的中间产物(合成路线如图4所示)，文献报道[12]，控制调节溴乙酰-7-ACA与N,N'-二异丙基硫脲反应时的温度可有效地降低溴乙酰-7-ACA的残留，再进一步精制可使其含量再降低，说明目前各厂家原料合成过程中初始原料的配比以及反应条件控制得更精确，工艺更优化。

3 杂质结构确证

采用柱切换LC-MS方法，对注射用头孢硫脒样品中全部6种杂质结构进行了确证。

3.1 杂质1结构确证

杂质1的+EMS图及+EPI@m/z431.3[M+H]+的二级质谱如图5所示，由该杂质的质谱图可知，该杂质的[M+H]+峰为431.0，分子量为430.0；根据EPI碎片离子，推测裂解途径如图6所示，推测杂质1为头孢硫脒3位侧链脱去乙酰基后形成的降解杂质，即去乙酰头孢硫脒。

3.2 杂质2结构确证

杂质2的+EMS图及+EPI@m/z431.2[M+H]+的二级质谱如图7所示，该质谱图中存在m/z431.0[M+H]+峰以及m/z452.9[M+Na]+峰，因此推断其分子量为430.0；根据分子量，初步判断该杂质可能为杂质1的同分异构体(包括Δ-3异构和7S异构)以及去乙酰氧头孢硫脒的亚砜异构体。

质谱图中存在m/z201.2、m/z159.2以及m/z117.2的碎片峰，说明杂质分子中含有与头孢硫脒相同的7位侧链；存在m/z258.2的碎片峰，说明发生了头孢类化合物典型的A型裂解，进一步说明该杂质含有与头孢硫脒相同的7位侧链；而对于m/z313.1碎片离子裂解途径的推断可以判定该杂质不是去乙酰氧头孢硫脒的亚砜异构体，推测裂解途径如图8所示。

比较杂质1和杂质2的紫外光谱图(图9)可知，两个杂质的最大吸收波长一致，推断两个杂质的共轭结构一致，故初步推断杂质2为杂质1的7S异构体，该杂质属于头孢硫脒的降解产物。在注射用头孢硫脒的一些部颁标准中需要控制氯乙酰-7-ACA(头孢硫脒酰化物Ⅱ)，该杂质相对头孢硫脒的保留时间为0.4，与杂质2一致，在进行检验中容易将杂质2误判为头孢硫脒酰化物Ⅱ，通过此次质谱分析，明确了该杂质结构，确定了头孢硫脒原料及制剂中均未检出头孢硫脒酰化物Ⅱ。但在目前中国药典2015年版头孢硫脒有关物质分析的色谱方法中，无法准确区分杂质2和头孢硫脒酰化物Ⅱ。

3.3 杂质3结构确证

杂质3的+EMS图及+EPI@m/z415.2[M+H]+的二级质谱如图10所示，由该杂质的质谱图可知，该杂质的[M+H]+峰为415.1，推测其分子量为414.1；根据EPI碎片离子，推测裂解途径如图11所示，推测杂质3为头孢硫脒3位侧链脱去乙酰氧基的降解杂质，即去乙酰氧头孢硫脒。

3.4 杂质4结构确证

杂质4的+EMS图及+EPI@m/z413.3[M+H]+的二级质谱图如图12所示，由该杂质的质谱图可知，该杂质的[M+H]+峰为413.3，推测其分子量为412.3，其裂解规律与杂质3类似，推测裂解途径如图13所示，推测杂质4为头孢硫脒内酯。

3.5 杂质5结构确证

杂质5的+EMS图及+EPI@m/z489.0[M+H]+的二级质谱图如图14所示，由该杂质的质谱图可知，该杂质的[M+H]+峰为489.1，推测其分子量比头孢硫脒多了16Da，说明杂质5比头孢硫脒多了一个氧原子。进一步的二级质谱分析表明，存在m/z429.0的脱3位侧链特征碎片峰，推断该氧原子在母核或7位侧链上，二级质谱图中存在m/z201.1、159.1和117.1 3个7-位侧链特征碎片峰，故氧原子不在7-位侧链上而是在母核上，初步推断为母核6元杂环中的硫原子形成亚砜，此杂质属于头孢硫脒合成过程中的工艺杂质。裂解途径如图15所示。

3.6 杂质6结构确证

由于杂质6在质谱中不易电离，我们采用了QExactive Focus高分辨质谱仪对杂质6进行柱切换分析。其一级质谱图如图16所示，在一级质谱图中，丰度较高的3个离子峰(m/z为489.91、412.86和384.87)均有同位素峰，且同位素丰度比为1:2:1，推断这些离子峰中均含有2个Br原子。m/z为489.91的离子其二级质谱图如图17所示，由图中可知，其二级质谱包括了m/z为412.86和384.87的碎片离子，两个碎片离子与m/z为489.91的离子相差77.05和105.04，根据头孢硫脒裂解规律，此应为脱去3位侧链产生的碎片离子，故推测此化合物3位侧链与头孢硫脒相同；此化合物并未产生头孢硫脒7位侧链特征碎片离子(m/z201、159和117)，故推测此化合物7位侧链也与头孢硫脒不同；在二级质谱图中，产生了m/z156.01的碎片离子，此离子为头孢硫脒母核进行A裂解后的典型碎片离子，故推测此化合物可能与头孢硫脒具有相同的母核结构。此化合物[M+H]+峰为偶数，故此化合物含氮原子数目与头孢硫脒不相同。综合上述结果，初步推断此化合物为头孢硫脒原料中的工艺杂质。经调研，原料中含有此杂质的生产厂家所采用的合成路线与其它厂家是一致的，可能是合成反应过程中某个参数控制不当，造成了含溴中间体的产生，或者是合成的物料纯度不高，含有此杂质。

4 关键指针杂质的确定

综上所述，通过对头孢硫脒原料及注射用头孢硫脒中杂质谱的分析，对全部6种杂质的结构进行了确证，对其来源进行了分析，结果见表1。

表1 6种主要杂质名称、来源及检出水平Tab.1 The name, source and detected level of 6 main impurities

在全部厂家的原料以及制剂中，最大单个杂质均为杂质1，即去乙酰头孢硫脒，此杂质可进一步产生杂质2，即去乙酰头孢硫脒7S-异构体，杂质1脱水即可产生杂质3，即去乙酰氧头孢硫脒，而杂质1的3位羟基与4位羧基发生酯化反应即可产生杂质4，及头孢硫脒内酯。由此可见，头孢硫脒中的降解杂质2、3、4均与杂质1相关，故杂质1可作为关键指针性杂质反应产品的降解情况。头孢硫脒可通过多种途径产生杂质1，包括加热，酸降解、碱降解等，故此杂质的含量还可以反映出原料以及制剂在贮存、运输等过程中的条件是否合理。

原料及制剂中均未检出头孢硫脒酰化物(酰化物Ⅰ、Ⅱ)，说明目前在原料合成过程中，生产厂家已经注意控制起始原料的质量、反应物的配比以及工艺参数，使得头孢硫脒酰化物杂质的产生降到最低，远低于质量标准中要求的限度。但个别厂家原料中产生了新的工艺杂质，即杂质6，质量标准中应对此杂质进行关注，以全面反映原料生产过程中的工艺控制。杂质6可作为反映产品生产工艺控制情况的指针性杂质。

5 头孢硫脒原料晶型

头孢硫脒原料存在多种晶型，不同晶型的化学稳定性不同。对4个不同厂家的原料进行粉末X-衍射分析，衍射图谱如图18所示，各厂家原料均为结晶型原料，特征衍射峰的峰位置、数量及相对强度基本一致，只是在2θ为15～20°之间的衍射峰数量及峰形略有不同，说明各厂家头孢硫脒原料晶型基本一致。该结果提示，良好的工艺控制，可以保证头孢硫脒原料最终产品均有较好的晶型，进而保证制剂产品的稳定性。

6 结论

综上所述，头孢硫脒原料及注射用头孢硫脒中共检出6种主要杂质，杂质种类较少，各厂家制剂产品中杂质含量均小于现行标准规定的限度，制剂有关物质整体水平较好，这说明良好的原料晶型控制可以在一定程度上保证制剂的质量。确定针对降解反应以及工艺控制的关键指针性杂质，有助于从杂质谱方面更加准确快速地了解产品质量以及生产工艺情况。