细菌整体代谢与新抗生素及抗生素增效剂靶标

刘聪 冯佳妮 李玮玮 朱伟伟 薛云新 王岱 赵西林

(厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，厦门 361102)

第二次世界大战中青霉素的问世[1]，使得数以万计的战伤士兵免受伤口感染，抗菌素自此开始进入人们的视线。随着大量抗菌素被发现，抗菌素时代的帷幕由此掀开。抗生素似乎成为了一个被称为“魔术子弹”的万能灵药而被大量使用甚至滥用，由此引发的细菌耐药越来越严重，多重耐药菌乃至广泛耐药超级细菌的出现使得现代抗感染治疗无药可用。在临床耐药分离株中，常见的大肠埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)及鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的比例大幅上升[2]。全世界的研究者试图探明抗生素的杀菌机制，以找到对抗耐药细菌的武器，然而抗生素杀菌机理的揭示远比发现抗生素本身的时间要晚：2007年《Cell》刊发的一篇论著首次提出了经典抗生素普遍依靠活性氧(reactive oxygen species， ROS)来介导杀菌的观点，该观点过去十几年里已获得广泛认可并在随后的研究里不断被证实[3]。

鉴于ROS对抗生素杀菌具有重要作用，越来越多的研究聚焦于如何使细菌产生更多的ROS来促进杀伤。本文主要综述了细菌胞内代谢节点的扰动对中央碳代谢流量及下游ROS生成的影响，试图从整体代谢的角度寻找潜在的抗生素靶标或增效佐剂。

1 抗生素介导的细菌死亡与胞内ROS的联系

所有好氧生物都离不开氧气，因为这些生物体内的有氧代谢都依赖O2参与来生成生命所需的能量以及各种代谢产物，但同时伴随ROS产生。ROS主要包括过氧化氢(H2O2)、有机氢过氧化物(ROOH)、超氧阴离子自由基(O2·−)、羟自由基(·OH)等；ROS有多种来源，包括有氧呼吸中的电子传递链、过渡金属离子及一些外界因素刺激(如电离辐射、化学氧化剂)，由此可见，ROS的产生难以避免[4]。ROS同时是一把双刃剑，既可作为多效信号分子调节代谢网络，也可能导致生理毒性，例如，ROS能靶向磷酸酶、直接影响激酶信号传导[5]，还能氧化破坏蛋白质、脂质和DNA。抗生素的杀菌正是基于过量ROS对胞内各种生物大分子的损伤，抗生素引发细菌累积的胞内ROS、介导了细菌死亡的观点目前已被广泛认同[6-9]。在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，不同细胞亚群在抗生素作用下累积的胞内ROS水平具有异质性，从而具有不同的药物敏感性：结核分枝杆菌会产生表型不同但遗传一致的两种亚群，分为短型菌(SC)和正常菌(NC)，通过密度梯度离心分离后，用异烟肼处理，结果表明NC亚群的胞内ROS(羟基自由基和超氧化物)水平明显低于SC亚群，与此对应，NC亚群在药物处理后的存活率明显高于SC亚群；此外在药物处理前将硫脲(ROS清除剂)添加至液体培养基，能够抑制抗生素对细菌的杀伤作用[10](表1)。这些表明，抗生素介导产生的致死剂量ROS是杀菌的关键物质。

表1 调节抗生素功效的小分子及其干扰的代谢途径Tab.1 Small molecules regulating antibiotic efficacy by interfering metabolic events

一项针对抗生素诱导后胞内代谢组的研究支持了上述观点[11]。研究者采用3大类经典抗生素(诺氟沙星、卡那霉素及氨苄西林)，使用不会使细胞裂解但又足够产生高度损伤的抗生素浓度，分别处理细胞30、60和90 min，然后用高效液相色谱/气相色谱/电喷雾串联质谱检测胞内代谢物的变化，层次聚类分析3类抗生素共同引起的变量。结果发现，相较于未处理的细胞，经抗生素处理的细胞培养物，三羧酸循环中柠檬酸盐和琥珀酸盐的浓度明显增加，NAD+及其合成前体的含量升高，4-氨基嘧啶并咪唑的浓度也增加，由此说明氧化磷酸化水平的上升及三羧酸循环的加强；另外，核苷酸浓度下降、黄嘌呤增加，可能意味着DNA受损的程度增加；谷胱甘肽池也发生了改变，还原型的浓度部分升高，氧化型的则显著增加，说明胞内氧化应激呈现较高水平；并且，一些有毒代谢产物的浓度上升，包括被金属攻击产生羰基化的蛋白、Fenton反应产物参与情况下由脱氧核糖或亚油酸生成的丙二醛[12]、被ROS攻击形成的8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤。综上整个代谢组的数据可知，抗生素处理的细胞正在经受大量的ROS攻击。

无独有偶，洪宇植等[13]发现，如果在ROS累积到促使细胞死亡的浓度阈值前、寻找到合适时间窗口及时将ROS清除，可以使带有原始靶标损伤的细胞避免死亡。研究者使用新鲜培养基将大肠埃希菌培养至对数前期，然后使用1×MIC(minimum inhibitory concentration)浓度的萘啶酸处理、诱导细菌产生胞内ROS，然后离心菌液，使用0.9%的生理盐水重悬细胞，再次离心重悬，最后将洗去药物的细胞分别铺于LB琼脂板和含有0.5×MIC联吡啶(ROS清除剂)的LB琼脂板，则后者琼脂板上的细胞存活率提高了约30倍。由此可见，即便在移除了抗生素等原始致死压力因子后，ROS介导的杀菌进程仍能持续进行；无论在抗生素治疗中或在治疗后，及时抑制ROS累积和清除过量ROS，都可能导致抗生素杀伤的失败。

2 胞内的氧化应激系统

细菌胞内的氧化应激主要由OxyR和SoxRS两个组分响应调控，前者响应来自过氧化氢的压力，后者响应来自超氧阴离子自由基的压力[14]，另外一般压力调节响应因子RpoS及受其调控的下游相关蛋白也参与了氧化应激[15-16]。MqsR/MqsA毒素/抗毒素系统参与调控氧化应激时的RpoS水平，正常生理状态下，MqsA结合至rpoS启动子区域，抑制其表达；而在受到氧化压力后，Lon蛋白酶会切割MqsA，使rpoS启动转录，RpoS识别下游氧化应激蛋白的启动子，招募RNA聚合酶，增强这些蛋白编码基因的转录水平[14]。RpoS调控的主要氧化应激蛋白有Dps(DNA结合蛋白，可以氧化游离的亚铁离子，生成水合三氧化二铁，避免了Fenton反应的发生)，KatE(过氧化氢酶II，负责清除过氧化氢)，XthA(核酸外切酶III，可以修复过氧化氢诱导的DNA断裂)和SodC(超氧化物歧化酶C，负责将超氧自由基转化为过氧化氢和水)。

OxyR蛋白可呈现还原态和氧化态[17]，两种状态均能结合DNA，但还原态OxyR抑制靶基因转录，而氧化态则激活转录。在正常细胞生理状态下，还原态OxyR结合于oxyR启动子区域，抑制自身转录；当细胞处于氧化应激时，OxyR转为氧化形式，激活oxyR转录，大量OxyR表达后被氧化，进而结合到下游氧化应激基因的启动子区域，激活其转录。氧化态OxyR调控的主要氧化应激蛋白有KatG(过氧化氢酶Ⅰ，负责清除过氧化氢)和AhpC(烷基过氧化氢还原酶，负责清除过氧化氢)。

SoxRS系统主要由SoxR、SoxS及其下游蛋白组成[18]，在正常细胞生理状态下，SoxR处于还原态、并与soxS启动子结合，但无法激活该启动子，soxS此时处于微弱表达状态以应对正常代谢产生的低水平ROS。当ROS水平和正常代谢的稳态被打破，SoxR作为超氧阴离子自由基的感受器，被激活成相应的氧化态，进而激活soxS转录，随后大量表达的SoxS结合到受其调控的系列下游基因启动子区域，包括Nfo(核酸内切酶IV，具有嘌呤/嘧啶AP位点内切活性)、SodA(超氧化物歧化酶A，能解毒超氧阴离子，减轻氧化损伤)和Zwf(6-磷酸葡萄糖脱氢酶，可以增强磷酸戊糖代谢通路，生成NADPH，逆转胞内过度氧化状态)。

3 整体代谢与氧化还原稳态

3.1 氧化磷酸化与氧化应激

ATP带有高能磷酸键，水解时释放能量，用以完成生物体的各种耗能过程，是生物活动最直接的能量来源[19]。ATP合成通常有两种方式，一是底物水平磷酸化，化合物在分解过程中生成高能代谢物，由其将能量传递到ADP生成ATP；二是氧化磷酸化，化合物在分解过程中将能量转移至还原性辅酶，辅酶则通过电子传递链把电子传递给氧，同时逐步释放能量生成ATP。辅酶中的电子传递到氧的过程称为氧化，ADP生成ATP的过程则称为磷酸化，这两个过程相互耦连，合称为氧化磷酸化[20]。抗生素与细菌胞内的靶标相互作用，刺激三羧酸循环产生更多NADH和FADH2，NADH和FADH2则会过度活化电子传递链，导致胞内生成过多的超氧阴离子，诱发产生超过胞内氧化应激体系所能承受的ROS水平，使ROS积累成为一种不可阻挡的级联放大趋势，最终氧化破坏胞内多种重要大分子(DNA、蛋白质、质膜)，致使细菌死亡[21]。

在牛分枝杆菌的研究显示[22]，异烟肼处理细菌后，胞内ATP含量迅速上升，且与时间和药物浓度正相关。ATP作为电子传递链状态的生理指标，其含量异常上升提示细菌被抗生素处理后电子传递链处于过度活化状态，胞内可能处于高度氧化应激水平，这种猜测通过特异探针检测胞内ROS含量得以验证，药物处理后确实引发了细菌胞内ROS水平的迅速升高。如将异烟肼与靶向分枝杆菌电子传递链的药物(Q203或苯达喹啉)联合使用，则显著削弱了异烟肼介导的ATP增强效应，最终抑制了该药物的杀菌活性(表1)，从而说明异烟肼正是通过靶向细菌胞内氧化磷酸化的代谢途径来介导杀菌效果。

例4.Shantou,then known as Swatow,was China’s third-largest port after Shanghai and Guangzhou and the port of departure of the Teochew diaspora...(China Daily,2018-05-23)(汕头，广州，潮州）

3.2 三羧酸循环与氧化应激支

三羧酸循环是需氧生物普遍存在的代谢途径，是糖类、脂质、氨基酸的最终代谢途径，同时也作为三者之间的枢纽将它们的代谢相互协同。一分子乙酰辅酶A完整历经三羧酸循环后会产生三分子NADH、一分子ATP和一分子FADH2，其中NADH和FADH2会在电子传递链释放ATP，因此有氧呼吸能够产生更多的能量供生物体进行生命活动[23]。作为三大类物质的联系枢纽，三羧酸循环的中间产物草酰乙酸可进入糖异生途径，也可通过转氨基作用生成氨基酸，此外乙酰辅酶A也能参与脂质生成，甚至核苷酸代谢也与三羧酸循环相关。电子传递链作为能量代谢的枢纽，其活跃程度也与三羧酸循环紧密相关[24-25]。由此可见，三羧酸循环碳通量的流向也决定了胞内氧化应激的状态。

Collins等[3]研究发现，使用3大类抗生素(喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类)对大肠埃希菌进行药物处理，胞内NAD+/NADH比值相比处理前大幅上升，说明NADH消耗增加，这可能会导致胞内出现较高的氧化应激水平；并且，药物处理后细胞培养物的胞内羟基自由基水平确实大幅提高。此外，三羧酸循环中产生NADH的关键基因敲除后，细菌能在一定程度抵抗抗生素的杀灭作用，进一步说明了三羧酸循环与胞内氧化应激具有重要联系。因此，“抗生素刺激三羧酸循环产生致死量的ROS，最终杀灭细菌”的杀菌机制被提出。

3.3 糖酵解与氧化应激

糖酵解，也称糖的无氧氧化，是所有利用葡萄糖作为能量物质的生物体共有的代谢途径。完整的糖酵解是以葡萄糖为底物最终生成丙酮酸的反应过程，总共包含有7个可逆和3个不可逆步骤。一个葡萄糖分子历经糖酵解后生成2分子丙酮酸和2分子ATP，释放的能量相对较少，是不完全的氧化过程[26]，但糖酵解的中间产物直接或间接地参与到胞内的还原性物质的生物合成途径，其中包括磷酸戊糖途径的衍生产物NADPH和谷氨酰胺分解的衍生产物还原型谷胱甘肽。此外，糖酵解的终产物丙酮酸在有氧情况下可以转化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环，而三羧酸循环则是胞内ROS的重要来源。由此可知，糖酵解流向是胞内氧化还原稳态的重要决定因素[27]。此外6-磷酸果糖是糖酵解的中间产物，同时也是肽聚糖的合成前体，而肽聚糖作为细菌外膜的重要组分，其也是核心碳代谢的主要排放途径之一。

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)使用β-内酰胺类抗生素(靶向青霉素结合蛋白，阻断细胞壁生成)处理后，导致核心碳代谢倾向于糖酵解的通量增加，引起与之关联的三羧酸循环的增强，进而刺激电子传递链产生过量ROS、使细菌死亡；细菌在通过敲除糖酵解关键基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapA)抑制糖酵解途径后，可以部分抵抗β-内酰胺类抗生素的杀灭作用，与此类似，细菌在糖异生(糖酵解的逆向途径)碳源培养基上生长，也获得了对药物的耐受性[28](表1)。由此，研究者证明了糖酵解活性的抑制或逆向流动可以补偿β-内酰胺类抗生素引发的代谢扰动，减少胞内的氧化损伤，从而抵抗其杀灭作用。此外，研究者发现粪肠球菌(Enterococcus faecium)能耐受β-内酰胺类抗生素，是因为其缺少呼吸链通路，即使在糖酵解通量较高的情况下仍不会产生较高的氧化损伤，从而佐证了上述提出的抗生素耐受原理。

3.4 长链脂肪酸氧化与氧化应激

长链脂肪酸是两性分子，通常由12～20个碳原子的脂肪烃链和一个末端羧基构成，在细菌胞内主要行使出种功能，一是作为能量物质为细菌物质代谢提供能量，二是作为细胞膜组分以磷脂的形式掺入细胞膜内，三是作为信号分子为胞内物质代谢传递信息[29]。长链脂肪酸是一种良好的储能物质，同等质量下长链脂肪酸彻底氧化提供的能量是糖类的两倍。长链脂肪酸在细菌胞内被活化转变为脂酰Co-A后主要以β氧化的方式降解，在历经一轮β氧化后生成一分子的乙酰Co-A和少了两个碳的新脂酰Co-A，乙酰Co-A进入三羧酸循环为细胞供能，新脂酰Co-A则可继续进行新一轮的β氧化。一轮β氧化会产生一分子的FADH2和NADH，无论是进入三羧酸循环还是β氧化产生的辅酶因子最终都会在电子传递链被氧化[30]，而这种能量利用的形式必然会给细菌产生氧化还原压力。

一项大肠埃希菌中的研究显示[31]，通过只添加脂肪酸作为碳源的培养基筛选获得的突变株对脂肪酸具有更高利用率。突变株相较野生型表现出更低的ROS含量，推测可能是突变株中更低的氧化应激水平能够支持其利用更多的脂肪酸；全基因组测序发现rpsA发生了突变，将这种突变导入到野生型细菌中，同样导致较低的ROS含量和更高的脂肪酸利用率。此外，细菌在oxyR敲除后于油酸钠作为唯一碳源的培养基中表现出明显的细胞生长缺陷，与之相反，将硫脲(ROS清除剂)添加至培养基后，该突变菌对脂肪酸的利用率明显提高。综上所述，细菌利用脂肪酸作为碳源进行生长代谢时会面临较高的氧化应激压力。

3.5 磷酸戊糖途径与氧化应激

一项大肠埃希菌的研究证实了该观点[41]，研究者在指数期大肠埃希菌中加入了1 mmol/L过氧化氢，并对30 min内胞内的代谢物水平进行跟踪测量，发现磷酸戊糖途径在5 s内就应激加强，6-磷酸葡萄糖酸酯快速积累，糖酵解途径响应稍慢，在30 s内1,6-二磷酸果糖和磷酸烯醇式丙酮酸物质含量下降。这些数据表明，在胞内氧化应激水平快速升高的时候，细菌会迅速增加糖酵解流向磷酸戊糖途径的通量、并关闭糖酵解途径，以产生更多的具有还原电势的NADPH来应对ROS。此外，研究者发现逐级抑制Zwf活性会使大肠埃希菌对过氧化氢敏感性逐步上升，这同样佐证了磷酸戊糖代谢对细胞氧化应激的重要性。

3.6 丙氨酸代谢与氧化应激

细菌的丙氨酸主要合成途径一般由谷氨酸-丙酮酸转氨酶催化转移谷氨酸的氨基到丙酮酸，这是一个可逆反应，丙氨酸同样也可逆转生成丙酮酸，然后经由乙酰辅酶A进入三羧酸循环被氧化成二氧化碳和水[42]。此外，丙氨酸也可藉由三羧酸循环中的草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，然后逆转糖酵解途径生成3-磷酸甘油醛进入磷酸戊糖途径，而磷酸戊糖途径中间产物5-磷酸核酮糖则是核黄素生物合成的前体之一[43]。因此，丙氨酸代谢实际上通过丙酮酸连接了三羧酸循环、磷酸戊糖途径以及核黄素合成。

近期一项研究发现[32](表1)，添加丙氨酸可以增强卡那霉素对耐药细菌的杀灭作用，通过对添加丙氨酸处理的耐药细菌的蛋白质组学和代谢组综合分析发现，三羧酸循环、碳代谢、氨基酸代谢和核黄素代谢均上调表达。核黄素是辅酶FAD的生物合成前体，其产量增加可能会刺激电子传递链产生更多ROS。转录分析发现，丙氨酸存在时转化核黄素为FAD的相关基因ribB、ribC和ribF均上调表达。此外，外源丙氨酸的添加还下调了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽转移酶等抗氧化应激系统的转录水平，最后通过对细菌胞内ROS含量测定发现，单独添加丙氨酸或卡那霉素均增加了氧自由基的产生，两者联合使用则显著提升了ROS水平。由此可知，丙氨酸添加会抑制氧化应激系统，并依次通过丙氨酸代谢、三羧酸循环、糖异生途径、磷酸戊糖途径、核黄素代谢来诱发细菌产生过多的ROS。

3.7 丝氨酸代谢与氧化应激

细菌的L-丝氨酸生物合成是糖酵解的分支途径。SerA负责催化从3-磷酸甘油酸到3-磷酸-羟基丙酮酸的反应，同时生成一个NADPH分子，将葡萄糖酵解的流向介导至L-丝氨酸分支途径[44]，再经中间产物3-磷酸丝氨酸，即可合成目的产物L-丝氨酸。丝氨酸代谢是细菌胞内的重要生物途径，丝氨酸能与甘氨酸、苏氨酸等相互转化，是胞内很多化合物代谢的中间产物。L-丝氨酸的降解则是由三个L-丝氨酸脱氨酶催化完成，通过一步反应脱去氨基生成丙酮酸盐[45]，丙酮酸再分流到三羧酸循环中被氧化成二氧化碳和水。

L-丝氨酸可以提高大肠埃希菌对氟喹诺酮类抗生素的敏感性[33](表1)。外源添加的L-丝氨酸会被大肠埃希菌中的丝氨酸脱氢酶转化成丙酮酸，然后进入三羧酸循环，而三羧酸循环会消耗NAD+，产生NADH[46]。在与L-丝氨酸共同孵育的情况下，相比只含有氧氟沙星或莫西沙星的对照组，NAD+/NADH的比值提高了约2倍。三羧酸循环增强则加速电子传递链的活化，促进超氧阴离子的生成，进而破坏铁硫簇，释放游离铁。使用比色铁氧嗪法测定胞内三价铁的含量，数据显示在与L-丝氨酸共同孵育的情况下，三价铁含量明显升高。三价铁与二价铁相互转换，而游离的二价铁能与过氧化氢发生Fenton反应、产生具有更高氧化活性的羟基自由基，进而诱发多种细胞损伤和其他ROS基团的生成，形成一种恶性循环，让ROS不断积累[47]。通过ROS分析试剂盒测定胞内ROS的含量发现，在与L-丝氨酸共同孵育的情况下，胞内ROS的含量明显升高。这些结果表明，外源丝氨酸的添加会通过自身代谢流入三羧酸循环，进而刺激细菌产生更多的ROS。

3.8 核苷酸代谢与氧化应激

DNA是生物遗传信息的携带者，指导生物体在不同的生命周期完成相应的生命活动。细胞内DNA的合成前体为4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，它们均由磷酸基团、脱氧核糖和含氮碱基3种基本单元构成。含氮碱基的从头生物合成是高耗能的途径，要消耗8分子ATP才能从1个葡萄糖分子合成1个腺嘌呤分子[48]。核苷酸合成代谢是一个错综复杂的庞大网络，生物体在合成少量核苷酸时，通过嘌呤、嘧啶的挽救途径和物质转化来合成核苷酸的方式显然更加合适，但在面对核苷酸大量需求时，从头合成途径也是重要的参与者。在抗生素处理下，DNA、嘌呤、嘧啶以及游离dNTP被细菌胞内产生过量的ROS氧化破坏，需要合成大量的核苷酸进行受损碱基的切除修复[49]。

外源添加腺嘌呤可以削弱3大类抗生素的杀伤作用[34](表1)。添加腺嘌呤后，细胞内的腺嘌呤核苷酸出现累积富集，此外，三羧酸循环中琥珀脱氢酶的活性被抑制，琥珀酸含量增加，且伴随有富马酸含量减少。与之相对应的是，补充腺嘌呤后，由抗生素诱发的细胞耗氧率增强效应被削弱，腺苷酸能荷也适度下降，ATP合成相对减少。抗生素处理后引发了核苷酸氧化，刺激细胞合成大量ATP来满足核苷酸从头合成的能量需求，外源补充腺嘌呤可以通过嘌呤挽救途径来降低细胞的能量需求，从而削弱了抗生素处理诱发的三羧酸循环增强效应，避免了细胞产生致死性剂量的ROS。

4 结论和观点

ROS是抗生素杀灭细菌的关键致死因子，胞内氧化应激水平对抗生素的杀伤作用具有重要影响。ATP、糖类、氨基酸、脂质以及核苷酸的代谢扰动都会引发整体代谢的变化，进而改变细菌胞内的氧化还原稳态[50-51]。整体来说，这些代谢或归属核心碳代谢、或与其相互关联，某个代谢节点的扰动可能导致整体核心碳代谢的流向发生改变。核心碳代谢与细菌胞内ROS存在密切联系，所以从代谢全局出发，寻找干扰核心碳代谢流向的靶点、设计对应的药物来杀灭细菌或增强抗生素功效，是一个良好的抗菌策略(图1)。越来越多的研究发现，许多耐受细菌通过降低代谢强度甚至代谢停滞来抵御抗生素的杀伤[52]，究其原因，也是因为核心碳代谢不活跃、避免了ROS过量产生。同样，可从整体代谢出发寻找激活细菌细胞代谢的节点，使细菌重新呈现对抗生素杀菌敏感的表型。综上所述，从整体代谢寻找抗生素靶标或抗生素佐剂，可能是一个未来可期且行之有效的方法，值得进一步深入探索。