青贮发酵饲料中三株乳酸菌的生理特性研究

孙亚楠，李 梅，刘玉龙，任玉，朱朝华，潘立超，任海伟

（兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

0 引言

乳酸菌（LBA） 是一类能够分解代谢碳水化合物并产生大量乳酸的一组细菌的统称。乳酸菌可增强动物机体免疫力，提高肠道黏膜免疫，帮助肠道消化，促进生长和繁殖，是一类具有明显益生功能的“益生菌”，且具有较好的生理特性。在农业、生物饲料、医药、食品等领域有广泛的应用[1-3]。

青贮饲料是反刍动物的重要粗饲料来源，是推动畜牧业发展的主要动力。在青贮饲料的制备过程中，乳酸菌在厌氧条件下发酵产生有机酸，从而迅速降低饲料的pH 值，在较低的pH 值环境下，其他有害微生物的生长会受到抑制，从而延长了饲料的储存期，减少了青贮饲料中营养物质的消耗和破坏，可以有效提高青贮发酵饲料的品质[4]。许多研究表明，青贮时添加乳酸菌不仅能够增加青贮饲料的能量和蛋白等营养物质，还可以在青贮过程中产生具有抗菌活性或抗氧化作用的乳酸、乙酸等功能性代谢产物[5-7]。青贮时挑选出繁殖能力快、产酸能力强的精良乳酸菌菌株，是制备精良添加剂的核心，也是青贮最终能成功的重要决定因素[8-13]。近年来，乳酸菌在生物饲料领域的研究显著增多，谢华德等人[14]研究乳酸菌对象草青贮发酵品质的影响，发现添加LAB 可以改善象草发酵品质，提高象草青贮料的营养。何轶群等人[15]从玉米秸秆饲料中筛选到6 株产酸和抑菌效果良好的乳酸菌，其中植物乳杆菌的产酸性能最好。

3 株乳酸菌在青贮过程中均扮演着重要的角色，其中植物乳杆菌作为一种同型发酵乳酸菌，相比异型发酵乳酸菌，有产酸速率高、青贮饲料中干物质含量损失更少等优势[11]。戊糖片球菌是青贮过程中的固有乳酸菌菌种，可以显著提高家禽的饲料转化率和青贮发酵速率，改善青贮饲料的品质[12]。类干酪乳杆菌RSI 安全，无致病性，在抑制病原菌、调节细胞免疫方面效果显著，是一株优秀的工业菌株[13]。

因此，对3 株乳酸菌生长特性进行研究，筛选出适合用于青贮的精良菌株，目的在于获得更具优良生物特性的乳酸菌，以期为更好地在青贮饲料中利用乳酸菌及其开发利用奠定基础[14-19]。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂

MRS 培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 g，柠檬酸氢二氨2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.1 g，硫酸锰0.05 g，磷酸氢二钾2 g（琼脂15 g）；加蒸馏水至1 000 mL。

1.2 仪器与设备

立式电热压力蒸汽灭菌器、智能生化培养箱、紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；SBA～40X 型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所产品；PBH-5 型便携式酸度计，杭州雷磁分析仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化、纯化

供试3 株乳酸菌为兰州理工大学生命科学与工程学院实验室所保藏。

（1） 活化。将植物乳杆菌、类干酪乳杆菌和戊糖片球菌3 株乳酸菌接种于MRS 液体培养基表面，在37 ℃的培养箱中培养48 h，当培养基出现浑浊时取出。

（2） 纯化。各取0.2 mL 活化后的菌株分别涂布于MRS 固体培养基表面，37 ℃条件下厌氧培养48 h。待单菌落生长，结合菌落形态观察等综合鉴定为纯菌株，然后作为测试菌种进行纯培养。

1.3.2 菌种的培养

以体积分数为1%的接种量[20]将不同乳酸菌在MRS 培养基（液体） 上接种，分别在不同的温度（20，30，37，42，50 ℃） 和pH 值（3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5） 下培养48 h。每隔3 h 取样1 次，在波长600 nm 的可见光条件下用分光光度计测其OD值绘制生长曲线，并测定样品中的乳酸浓度和pH 值。

（1） 菌株的温度生长试验。设置5 个温度梯度（20，30，37，42，50 ℃），在经严格灭菌的150 mL的MRS 液体培养基（pH 值为6.5） 上，接种体积分数为1%的活化菌种[20]，置培养箱中厌氧培养48 h。从接种开始每隔3 h 取样9 mL 于离心管中，分别测定其中的OD 值、pH 值及乳酸浓度。

（2） 菌株的pH 值生长试验。设置不同pH 值梯度的MRS 液体培养基，pH 值参数分别为3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5。用1 mol/L 的NaOH 和HCl 溶液调节灭菌前的pH 值。在150 mL 经严格灭菌处理的MRS 液体培养基（温度为37 ℃） 上以体积分数为1%的接种量接种活化菌种，置于培养箱中厌氧培养48 h[20]。从接种开始每隔3h 取样9 mL 于离心管中，分别测定其中的OD 值、pH 值及乳酸浓度。

1.4 数据分析

用Excel 软件绘制图表，对不同温度和pH 值处理的OD 值和乳酸浓度进行分析，从而得到乳酸菌的最适生长条件。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌的生理特性研究

2.1.1 温度对植物乳杆菌影响

不同温度下植物乳杆菌中乳酸质量浓度、pH值、OD 值的变化见图1。

由图1（a） 可知，植物乳杆菌在20 ℃培养时，9 h 后乳酸质量浓度下降，21～30 h 乳酸质量浓度稳定，产酸速度基本为零，30 h 后乳酸质量浓度开始有缓慢上升；在30 ℃培养时，接种3 h 后开始产生乳酸，3～6 h 产乳酸速度最快，6～33 h 乳酸质量浓度基本稳定，33 h 后乳酸质量浓度开始上升；在37 ℃培养时，3 h 后开始产生乳酸，3～9 h 间产酸速度最快，此后在21～48 h 期间乳酸质量浓度基本稳定，产酸较少；在42 ℃培养时，3～6 h 产酸速度最快，在21～48 h 时，产酸较为平稳；在50 ℃时检测到的乳酸含量一直很低，可以判定植物乳杆菌在50 ℃不生长。由图1（b） 可知，菌液的pH 值基本维持稳定，在50 ℃培养时取得样液的pH 值基本不变，植物乳杆菌在50 ℃时不产生乳酸。且由图可知pH 值变化与乳酸质量浓度变化相对应，二者呈负相关。由图1（c） 可知，在20，30，37 ℃时，菌体密度变化情况基本相同，在培养一开始并没有出现明显改变，3 h 后细菌进入对数期生长，24 h 后逐渐生长迟缓，达到稳定期；在42 ℃时，乳酸菌对数期为3～12 h，12～48 h 菌体生长到达稳定期，之后进入衰亡期；在50 ℃时OD 值基本保持稳定不变，说明并无乳酸菌生长。

图1 不同温度下植物乳杆菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化

综上所述，当温度高于50 ℃时该植物乳杆菌无菌群扩增、产酸等生理现象，生命代谢基本停止。该植物乳杆菌可生存的温度需低于50 ℃，当温度处于适宜温度范围30～37 ℃时，菌体增殖和产酸效应均处于最佳，与苟拥军、黄玉军、李相禹等人[21-23]的研究结果相似，最适的发酵温度均在该范围内；当温度高于适宜温度范围菌体生长至稳定期所需的时间延长；当温度低于适宜温度范围菌体的发酵过程中乳酸浓度会受到较大影响，在pH 值保持稳定的情况下乳酸被消耗，即乳酸消耗的同时有其他酸类物质生成。

2.1.2 pH 值对植物乳杆菌影响

不同pH 值下植物乳杆菌中乳酸质量浓度、pH值、OD 值的变化见图2。

图2 不同pH 值下植物乳杆菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化

由图2（a） 可知，植物乳杆菌在pH 值为4.5，7.5，8.5 的条件下培养时，主产酸期均为12～21 h，在21～30 h 的培养阶段产酸速度减缓，30 h 后乳酸质量浓度基本保持不变，最终乳酸质量浓度在pH 值为7.5，8.5 培养时最大，为1 280 mg/mL，在pH 值为4.5 的条件下培养时次之；在pH 值为5.5，6.5 的条件下培养，3 h 时开始产酸，之后产酸速度减缓，12～27 h 产酸速度增加，在27 h 后乳酸质量浓度保持稳定，在pH 值为5.5 的条件下培养时终产酸质量浓度与在pH 值为8.5 培养时基本相同；pH 值为3.5时，检测到的乳酸含量一直很低，可以得出植物乳杆菌在此pH 值条件下不生长，36 h 后乳酸质量浓度开始上升。由图2（b） 可知，在0～9 h 期间，初始pH 值为6.5 培养时pH 值下降最快，pH 值为5.5 培养时次之；初始pH 值为4.5，7.5，8.5 条件下培养时，在12～21 h 期间pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不变；初始pH 值为3.5 培养时，pH 值基本保持不变。由图2（c） 可知，初始pH 值为6.5 培养时，3 h 后细菌繁殖迅速，进入对数期生长，6 h 后生长逐渐迟缓，达到稳定期；初始pH 值为7.5 培养时，9 h 后细菌繁殖迅速，进入对数期生长，12 h 后生长逐渐迟缓，达到稳定期；初始pH 值为4.5 培养时，12 h 后细菌繁殖迅速，进入对数生长期，24 h后生长逐渐迟缓，达到稳定期；初始pH 值为5.5 培养时，9 h 后细菌开始大量生长，进入对数生长期，12 h 后逐渐趋于平缓，到达生长稳定时期，30 h 后又开始大量生长，直至36 h 生长迟缓，到达稳定期；初始pH 值为3.5，8.5 的条件下培养时，OD 值一直在缓慢增大，但一直处于较低的水平，说明基本无乳酸菌生长。

综上所述，随着发酵时间的不断延长，整个发酵体系的pH 值不断降低，最终稳定在pH 值3.5 左右。当发酵体系的pH 值达到稳定值3.5 后，pH 值不再大幅度的变化，即植物乳杆菌在pH 值低于3.5的条件下代谢受到抑制、无乳酸产生、菌体无扩增，菌体在该pH 值条件下无生命特征。菌体的扩增、产酸基本是同时进行的，该植物乳杆菌的最适pH 值为6.5，在此pH 值条件下菌体最快度过迟缓期，最快进入对数期和稳定期。陈境等人[24]的研究发现pH 值6.8 作为最适初始pH 值，可以使植物乳杆菌相关的酶活性增加，促进其生长。M V Leal-Sánchez 等人[25]也报道了植物乳杆菌LPCO 的最适发酵pH 值范围为4.5～6.5。当pH 值高于或低于6.5 时，菌体的生长速率和产酸效应会出现一定程度的负效应，其程度与pH 值偏离6.5 的幅度呈正相关，该特性与李娜等人[26]报道的pH 值对植物乳杆菌ZJ316 的影响相一致。pH 值对该植物乳杆菌发酵过程的影响规律与文献报道基本一致，主要差异在它们的酸稳定性，苟拥军等人[21]报道的果浆发酵中的植物乳杆菌在pH 值3.5 时仍可以增殖并产酸，杨悦、孙盛等人[27-28]报道的植物乳杆菌LV02 和WHH589 的pH 值耐受值也低于3.5。从青贮中分离得到的植物乳杆菌具有更强的适应性，能够在短时间内度过迟缓期，进入对数期并产酸[26-27]。

2.2 戊糖片球菌的生理特性研究

2.2.1 温度对戊糖片球菌影响

不同温度下戊糖片球菌中乳酸质量浓度、pH值、OD 值的变化见图3。

由图3（a） 可知，当pH 值为6.5，戊糖片球菌在20 ℃培养时，12 h 后乳酸质量浓度下降，21～33 h乳酸质量浓度基本稳定，产酸速度基本为零，33 h后乳酸质量浓度有所上升。在30，37 ℃培养3 h 后开始产乳酸，3～6 h 产乳酸速度最快，9 h 后乳酸质量浓度下降，12～27 h 乳酸质量浓度开始上升，27～33 h 乳酸质量浓度基本稳定，产酸速度基本为零，33 h 后乳酸质量浓度开始上升，且在37 ℃培养时，乳酸质量浓度1 480 mg/mL，达到最高；在42 ℃培养时，培养3 h 后开始产乳酸，3～6 h 产酸速度最快，之后乳酸质量浓度基本稳定且最大为1 440 mg/mL；在50 ℃培养时，检测到的乳酸水平一直很低，可以基本判定戊糖片球菌在50 ℃不生长。由图3（b） 可知，在20，30，37 ℃时，菌液的pH 值维持稳定，在50 ℃培养时取得样液的pH 值基本不变，戊糖片球菌在50 ℃不产生乳酸。且由图3 可知，pH 值变化与乳酸质量浓度变化相对应，二者呈负相关。由图3（c） 可知，在20，30，42 ℃时，菌体密度变化情况基本相同，在培养一开始并没有出现明显改变，3 h后乳酸菌进入对数生长期，6 h 后逐渐生长迟缓，到达稳定期，在20，42 ℃时，乳酸菌还会增加直到36 h 菌体密度保持稳定不变；在37 ℃时，可以看出3～21 h 时乳酸菌的对数生长期，稳定期为21～48 h；在50 ℃时OD 值基本保持稳定不变，说明并无乳酸菌生长。

图3 不同温度下戊糖片球菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化

综上所述，当温度高于50 ℃时该戊糖片球菌无扩增、产酸等生理现象，生命代谢基本停止。当温度处于20～42 ℃时，该戊糖片球菌能够增殖、产酸。且均从接种3 h 后开始快速产酸，其中温度在30，37，42 ℃时其产酸效果相近，20 ℃下的产酸效果明显较弱。其主要原因在接种3 h 后20，30，37，42 ℃发酵条件下的戊糖片球菌均进入对数生长期，受温度的影响，20 ℃条件下戊糖片球菌在达到稳定期后菌液质量浓度明显低于其他温度。

2.2.2 pH 值对戊糖片球菌影响

不同pH 值下戊糖片球菌中乳酸质量浓度、pH值、OD 值的变化见图4。

图4 不同pH 值下戊糖片球菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化

由图4（a） 可知，戊糖片球菌在pH 值为4.5，7.5，8.5 的条件下培养时主产酸期为12～21 h，而21～24 h 时产酸速度迟缓，24 h 后乳酸质量浓度基本达到稳定；在pH 值为5.5，6.5 的条件下培养时，3 h 后开始产酸，之后产酸速度缓慢增加，在pH 值为6.5 培养时终产酸质量浓度最大，为1 480 mg/mL；在pH 值为3.5 培养时，检测到的乳酸水平一直很低，可以判定戊糖片球菌在pH 值为3.5 时不生长，33 h 后乳酸浓度有所上升。由图4（b） 可知，在0～9 h 期间，初始pH 值为6.5 培养时pH 值下降最快，pH 值为5.5 时次之；初始pH 值为7.5，8.5 培养时，在12～21 h 期间pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不变；初始pH 值为4.5 培养时，在12～24 h期间pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不变；初始pH 值为3.5 培养时，pH 值基本保持不变。由图4（c）可知，初始pH 值为5.5 培养时，3 h 后细菌迅速繁殖，进入对数期，稳定期为33 h 后；初始pH 值为6.5 培养时，6 h 后细菌进入对数期，21 h 后到达稳定期；初始pH 值为4.5 培养时，12 h 后细菌开始迅速繁殖，进入对数生长期，27 h 后生长逐渐迟缓，达到稳定期；初始pH 值为7.5，8.5 培养时，12 h 后细菌开始迅速繁殖，进入对数生长期，21 h 后生长逐渐迟缓，到达生长稳定时期；初始pH 值为3.5 培养时，OD 值一直处于较低的水平，说明基本无乳酸菌生长。

综上所述，随着发酵时间的不断延长，整个发酵体系的pH 值不断降低，最终稳定在pH 值3.5 左右。当发酵体系的pH 值达到稳定值3.5 后，pH 值不再大幅度变化，即戊糖片球菌在pH 值低于3.5 的条件下代谢受到抑制、无乳酸产生、菌体无扩增，菌体在该pH 值条件下无生命特征。菌体的扩增、产酸基本是同时进行的，该戊糖片球菌的最适pH 值为6.5，在该pH 值条件下菌体产酸速度最快，最终乳酸浓度最高，菌体密度最大。与裴慧洁[29]研究结果相似，戊糖片球菌Z-1 在pH 值2～10 时具有良好的酸碱稳定性。试验结果与已有报道结果基本一致，而对于不同种类的戊糖片球菌，产酸存在差异性，潘佳雯[30]研究发现当pH 值为3.5 时，戊糖片球菌XY46可继续增殖。

2.3 类干酪乳杆菌的生理特性研究

2.3.1 温度对类干酪乳杆菌影响

不同温度下类干酪乳杆菌中乳酸质量浓度、pH值、OD 值的变化见图5。

由图5（a） 可知，类干酪乳杆菌在20 ℃培养时，3 h 后开始产乳酸，3～6 h 间产酸速度最快，12 h后乳酸浓度出现明显下降，21～33 h 乳酸质量浓度基本稳定，产酸速度基本为零，33 h 后乳酸质量浓度有所上升；在30，37 ℃培养时接种3 h 后开始产乳酸，3～6 h 产乳酸速度最快，此后在37 ℃时30 h 后乳酸质量浓度基本稳定，产酸量最多，为1 920 mg/mL；而在30 ℃培养时，21～33 h 乳酸质量浓度基本稳定，33 h 后乳酸质量浓度又开始上升，36 h 乳酸质量浓度基本稳定；在42 ℃培养时，接种3 h 后开始产乳酸，3～9 h 产乳酸速度最快，之后乳酸质量浓度一直呈缓慢上升状态；在50 ℃时培养时，检测到的乳酸水平一直很低，可以基本判定类干酪乳杆菌在50 ℃不生长。由图5（b） 可知，在20，30，37 ℃时，菌液的pH 值变化维持基本稳定状态，在50 ℃培养时样液的pH 值基本保持不变。且由图5 可知，pH 值变化与乳酸质量浓度变化相对应，二者呈负相关。由图5（c） 可知，在20～42 ℃时，菌体密度变化情况基本相同，在培养开始并没有出现显著改变，6 h之后细菌生长迅速，进入对数生长期，对数期过后逐渐趋于平缓，到达生长稳定时期；在50 ℃时OD值基本保持稳定不变，说明并无乳酸菌生长。

图5 不同温度下类干酪乳杆菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化

综上所述，当温度高于50 ℃时该类干酪乳杆菌无扩增、产酸等生理现象，生命代谢基本停止。当温度处于20～42 ℃时，该类干酪乳杆菌能够增殖、产酸。且均从接种3 h 后开始快速产酸，其中温度在37 ℃时产酸效果最佳，20 ℃下的产酸效果明显较弱。结论与李彬等人[31]研究的与副干酪乳杆菌（Lactobaci llusparacasei JCM1171） 的相似性为99.83%的CSND-6 菌株在30～44 ℃的温度范围生长基本一致。

2.3.2 pH 值对类干酪乳杆菌影响

不同pH 值下类干酪乳杆菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化见图6。

图6 不同pH 值下类干酪乳杆菌中乳酸质量浓度、pH 值、OD 值的变化

由图6（a） 可知，类干酪乳杆菌在pH 值为7.5，8.5 条件下培养时主产酸期为12～21 h，而21～33 h 期间产酸速度减缓，33 h 后乳酸质量浓度基本保持不变；在pH 值4.5 培养时，主产酸期为12～21 h，而21～48 h 期间产酸速度减缓，乳酸质量浓度不断增大；在pH 值为5.5，6.5 条件下培养时，3 h 时开始产酸，之后乳酸质量浓度下降，后来产酸速度缓慢增加，33 h 后乳酸质量浓度基本保持不变，在pH 值6.5 培养时终产酸质量浓度最大为1 920 mg/mL；在pH 值为3.5 培养时，检测到的乳酸质量浓度一直很低，可以判定类干酪乳杆菌在pH 值为3.5 时不产生乳酸。由图6（b） 可知，在0～9 h 期间，初始pH值为6.5 培养时pH 值下降最快，接下来为pH 值5.5培养；初始pH 值为7.5，8.5 培养时，在12～21 h 期间pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不变；初始pH 值为4.5 培养时，在12～24 h 期间pH 值下降最快，24 h 后pH 值基本保持不变；初始pH 值为3.5培养时，pH 值基本保持不变。由图6（c） 可知，初始pH 值为5.5，6.5 条件下培养时，3 h 后进入对数期，30 h 后到达生长稳定时期；初始pH 值为8.5 培养时，12 h 后进入对数期，21 h 后达生长稳定期；初始pH 值为4.5 培养时，12 h 后细菌迅速繁殖，进入对数生长期，30 h 到达生长稳定时期，终了菌体密度达到最大；初始pH 值为7.5 培养时，12 h 后细菌进入对数期，24 h 后细菌生长迟缓，36 h 到达稳定期；初始pH 值为3.5 培养时，30 h 后OD 值一直在缓慢增大，但一直处于较低的水平，说明基本无乳酸菌生长。

综上所述，随着发酵时间的不断延长，整个发酵体系的pH 值不断降低，最终稳定在pH 值3.5 左右。当发酵体系的pH 值达到稳定值3.5 后，pH 值不再大幅度的变化，即类干酪乳杆菌在pH 值低于3.5 的条件下代谢受到抑制、无乳酸产生、菌体无扩增，菌体在该pH 值条件下无生命特征。菌体的扩增、产酸基本是同时进行的，该类干酪乳杆菌的最适pH 值为6.5，在此pH 值条件下菌体产酸速度最快，pH 值下降最快，最终菌体密度最大。该结论与李彬等人[31]研究的CSND-6 菌株在pH 值为6～8 时生长较快的结论基本一致。

3 结论

（1） 对于植物乳杆菌，适合菌株生长的温度有20，30，37 ℃，适合产乳酸的温度为42 ℃。当pH值为6.5，温度为30 ℃（前期），42 ℃（后期） 梯度培养时，生长速度较快、菌体密度最大、最终乳酸质量浓度最高，可达到快速发酵的目的。

（2） 对于戊糖片球菌，适合菌株生长的温度有20，30，37 ℃，适合产乳酸的温度为37，42 ℃；当pH 值为6.5，温度为37 ℃培养时，生长速度较快，最终乳酸质量浓度最高。

（3） 对于类干酪乳杆菌，适合菌株生长的温度有20，30，37 ℃，适合产乳酸的温度为30，37 ℃；当pH 值为6.5，温度为37 ℃培养时，生长速度较快，菌体密度较大，最终乳酸质量浓度最高。

（4） 微生物的生长受到环境pH 值与温度的影响，在不同pH 值与温度下，影响程度差异较大。实验中的3 株乳酸菌在pH 值低于3.5 的条件下基本不生长；温度为50 ℃条件下基本不生长。

（5） 研究表明，酸度在一定程度上也能反映菌株的生长性能。菌株产酸量越高，环境的pH 值越低。乳酸菌在生长时pH 值下降较快的时间段为培养后3～9 h。在随后的培养时间里3 株乳酸菌的pH 值基本保持不变。