基于科研项目驱动型的本科导师制探索与实践

李俊辉，梁柳红，莫楚楚，赵子涵

（广东海洋大学 水产学院，广东 湛江）

《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）》指出：牢固确立人才培养在高校工作中的中心地位，着力培养 品学兼优、本领过硬的高素质专门人才和拔尖创新人才。高等教育承担着培养高级专门人才、发展科学技术文化、促进现代化建设的重大任务。高校越来越重视创新创业教育与专业学科的融合。结合科研项目，实施科教融合，将教学与科研实践有效结合起来培养本科生的创新创业能力是高校完善和提高教育教学水平的根本途径之一。本科生导师制是一种源于牛津大学并流传至今的人才培养模式，牛津大学针对本科生实施导师制的培养模式，鼓励学生在与导师面对面的交流讨论中不断激发科研创新能力。广东海洋大学水产学科是广东省高水平建设学科。自从2013年以来，大一新生入学后开始本科生导师的培养模式，由学生和导师进行双向选择，学生自愿报名，导师可以选择有意向报名学生。在双向选择后，导师为本科生讲解实验，并结合科研项目设立实验，指导本科生参与实验。本论文中大学生在导师指导下完成了“大珠母贝类胡萝卜素代谢相关基因PmApoL序列与表达模式分析”课题，这个完成实验与论文撰写过程中，学生的主动探索与导师的悉心指导，提高了本科生创新思维与能力。

一 材料与方法

实验用贝取自湛江市徐闻县承梧村海区，挑选无病害的2龄大珠母贝，剪取闭壳肌（A）、鳃（Gi）、外套膜边缘区（Me）、套膜区（Mp）、中央区（Mc）、足（F）和肝胰腺（He），所取组织放入液氮速冻，存于-80℃超低温冰箱，用于荧光定量分析。

利用试剂盒提取总RNA，通过反转录试剂盒将提取RNA反转录成cDNA, 实验步骤及条件均参照说明书进行。

通过分析大珠母贝转录组数据库，筛选与PmApoL基因相似度较高的unigene片段，利用软件Primer Premier 5.0设计中间片段，5′RACE和3′RACE所需要的基因特异性引物（表1）。

表1 基因克隆及荧光定量的引物序列

利用特异性引物PmApoL-F/PmApoL-R进行基因中间片段扩增，反应体系如下：Premix Taq 5 μL，模板cDNA0.4 μL，灭菌 ddH2O 3.8 μL。将反应程序设定为94℃预变性5min；94℃变性 30 s，61℃退火30 s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，证实为目的条带后连接至pMD18-T载体，并转化至感受态细胞，菌液培养1h后，涂布于含氨苄青霉素固体平板并倒置37℃培养10h，挑取阳性单克隆进行菌落PCR检测，将目的基因送至上海生物公司测序。

采用巢式PCR方法对PmApoL基因3′端和5′端进行RACE扩增。3′末端的扩增体系为10 μL：cDNA模板0.4 μL，PmApoL基因-3′-outer 0.4μL，UPM 0.4 μL，Premix Taq5μL，灭菌ddH2O 3.8μL。将退火温度改为58℃，其他反应程序同上。将第一轮得出的PCR产物用做第二轮PCR反应的模板，引物使用PmApoL-3′-inner，UPM换为NUP，其他反映程序不变。5′末端的扩增反应时，将引物换成对应的5′-outer和5′-inner，反应条不变。其余操作步骤同上。

利用 DNAMAN 软件的Sequence Assembly程序分别将PmApoL的中间片断与3′和5′端片段拼接起来，得到PmApoL的基因全长，共1857 bp。再用其Phylogenetic tree程序将大珠母贝PmApoL与其他物种PmApoL构建系统进化树，利用在线工具 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi ）对PmApoL基因进行开放阅读框（ORF）和蛋白序列的预测。使用NCBI (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线工具，将所得序列应用BLAST程序进行序列同源性比对和相似性分析，利用ClusterW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/clustalw2_phylogeny/）将大珠母贝PmApoL序列与其他物种序列进行同源性比对。使用SMART PRITION（http://smart.emblheidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1）程序获得PmApoL的结构域，即基因类型。通过使用通过ExPASy（http://web.expasy.org/vg/index/protein）对氨基酸序列的理化性质进行分析，运用SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal/)在线工具进行信号肽预测；用Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）搜索工具对PmApoL序列进行功能位点检测，用TMHMM Server v.2.0预测PmApoL的跨膜结构域，用SWISS-MODEL （http://swissmodel.expasy.org/）进行PmApoL的三级结构预测[1]。

通过实时荧光定量 PCR的方法探究大珠母贝不同组织中的表达差异进行分析，以GAPDH为内参。通过2-ΔΔCT计算法得出PmApoL在大珠母贝鳃、中央膜、闭壳肌、肝胰腺的相对表达量。用SPSS 19.0 软件进行显著性分析。显著性水平α=0.05。

二 结果与分析

根据大珠母贝RNA-Seq数据库中PmApoL的unigene序列设计基因特异性引物，利用RACE技术克隆了PmApoL基因的3端和5端序列，与中间片段拼接得到cDNA全长序列。结果显示，PmApoL序列全长913 bp，其中5′UTR序列长为142 bp；3′UTR序列长为54 bp；开放阅读框（ORF）长690bp，编码229个氨基酸。

图1 PmApoL基因的cDNA 序列及编码的氨基酸序列

利用ExPASy在线软件预测得PmApoL基因理论分子质量为24.38ku；等电点为8.88；负电荷残基26个，正电荷残基30个。氨基酸含量分析结果显示，脂溶指数（Aliphatic index）为114.19，不稳定指数 23.87，属于稳定蛋白；总平均亲水性（Grand averageofhydropathy,GRAVY）为 0.173，属于疏水性蛋白。用 TMHMM2.0预测PmApoL基因有两个跨膜结构域，分别在42-64和69-91位氨基酸，该分子属于膜蛋白。PmApoL的二级结构中，α螺旋结构占整体的76.86%，延伸链占7.86%，β 转角结构占4.37%，无规则折叠占10.92%。利用SMART软件分析，PmApoL基因有1个ApoL家族保守结构域（图2）。

图2 PmApoL蛋白质结构

利用MEGA7软件构建大珠母贝PmApoL基因与其他物种的进化树，发现与马氏珠母贝（Pinctada.imbricata）类聚为一个亚支，亲缘关系较近。大珠母贝和马氏珠母贝是两个近缘物种，PmApoL基因属于Apolipoprotein。

图3 邻接法构建的PmApoL家族系统进化树

荧光定量PCR技术分析PmApoL基因在闭壳肌、外套膜套膜区、中央区、足和肝胰腺组织的表达模式。结果显示，PmApoL基因在各个组织中均有表达，在肝胰腺表达量较高，在闭壳肌和足中表达量较低（图4）。

图4 基因在大珠母贝的不同组织中的表达量

荧光定量PCR技术分析PmApoL在大珠母贝6月龄幼贝的闭壳肌、外套膜边缘区、套膜区、中央区和肝胰腺组织的表达模式。结果显示，四个候选基因在各个组织中均有表达，其中PmApoL在肝胰腺表达量较高，在闭壳肌中表达量较低。

图5 基因在大珠母贝的不同组织中的表达量

载脂蛋白（ApoL）属于高密度脂蛋白家族，参与脂类物质的运输和代谢。类胡萝卜素作为一种脂溶性色素，其在体内的运输与代谢过程中依靠脂蛋白。通过分析大珠母贝套膜组织的RNA-Seq数据，筛选金色珍珠质色素沉淀相关基因，成功克隆了PmApoL基因的cDNA全长序列。PmApoL预测到1个载脂蛋白（ApoL）结构域。根据进化树分析，PmApoL与马氏珠母贝Pm-ApoL2基因聚在一个亚支，属于高密度脂蛋白家族[2]。在大珠母贝成贝与稚贝，PmApoL在肝胰腺组织中表达量最高，其次是外套膜，闭壳肌中表达量最低。雷超等人[3]研究发现Pm-ApoL2在马氏珠母贝的肝胰腺组织表达量最高，且与类胡萝卜素在肝胰腺组织的含量呈显著的正相关。胆固醇，类胡萝卜素等脂类物质在机体内运输和代谢过程依靠脂蛋白。家蚕血淋巴细胞主要通过高密度脂蛋白运载类胡萝卜素，其中90%为叶黄素[4]。无脊椎动物中，肝胰腺负责消化和吸收大量机体所需的养分，也是类胡萝卜素富集和代谢的重要组织[5-6]。PmApoL在肝胰腺组织特异性高表达，在大珠母贝中，推测PmApoL在肝胰腺组织对脂类的吸收和运输过程起重要作用。

三 结语

实践表明，自从实施本科导师制以来，学生通过本科生导师制这个平台，学生提早进入实验室，在导师指导下完成相关科研研究；在这个过程中，本科生与导师建立紧密的联系，使得课堂理论知识与科学实践有机结合，提高使学习的针对性和自主学习能力。更为重要的是通过实施本科生导师制与构建科教融合的培养模式显著提高了本科生的创新能力，取得了良好育人效果。