牛血清白蛋白与柚皮素复合物的非变性质谱研究

何源峰，苗 慧，朱龙平，陈 宝

(中山大学药学院，广东 广州 510006)

血清白蛋白是一种球状蛋白[1]，是人血液中含量最丰富的蛋白质[2]，在药物的运输、分布和代谢中起着至关重要的作用[3]。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)具有高度的同源性和76%的结构相似性[4]，且价格便宜、易获取，常被用作模型蛋白。因此，研究药物与BSA的相互作用，有助于了解其在体内的运输和分布情况，对于阐明药物的作用机制具有重要的意义。

柚皮素的结构示于图1，它是一种重要的黄酮类化合物，存在于各种柑橘类水果、西红柿和葡萄中[5]，具有多种药理作用，包括抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成和血管扩张等[6]。尽管柚皮素具有多种药理活性，但其对血浆蛋白的影响尚不清楚。

图1 柚皮素化学结构Fig.1 Chemical structure of naringenin

目前已有多种研究蛋白-配体相互作用的分析方法，如荧光光谱法、圆二色光谱法、等温滴定量热法、表面等离子体共振光谱法和核磁共振波谱法[7-9]等。但这些方法存在一定的缺陷，如样品消耗量大；分析时间长；在分析之前需要对蛋白质或配体进行标记、固定，容易导致偏差反应等。非变性质谱(native mass spectrometry)利用电喷雾电离(ESI)软电离技术将完整的蛋白质-配体复合物从液相转移到气相，该过程保持了较弱的相互作用，保留了生物大分子的结构和生物功能[10]。非变性质谱具有样品消耗量少、无需标记、简便、快速、灵敏等优点[11]，近年来已成功应用于蛋白质与配体之间的相互作用研究[12-15]。

本研究拟利用非变性质谱法研究BSA与柚皮素的相互作用，快速得到二者的相互作用方式、化学计量比、平衡解离常数、结合动力学等信息，希望为柚皮素的进一步开发和应用提供数据基础，为其他药物与血清白蛋白的相互作用研究提供借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Synapt G2-Si HDMS纳升电喷雾-四极杆-离子淌度-飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品；P-97毛细管拉制仪：美国Sutter Instruments公司产品；Milli-Q Advantage A10超纯水机：德国Merck Millipore公司产品。

1.2 材料与试剂

BSA：美国Sigma公司产品；柚皮素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；醋酸铵、甲酸：美国Thermo Fisher公司产品；甲醇：美国Honeywell公司产品；硼硅酸毛细管：美国Sutter Instrument公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

精密称取适量的BSA，用超纯水配制成50 μmol/L母液，备用。取适量的BSA母液，用200 mmol/L醋酸铵溶液稀释到5 μmol/L。

精密称取适量的柚皮素，用甲醇配制成3 mmol/L母液，备用。用200 mmol/L醋酸铵溶液将柚皮素稀释到100 μmol/L。

将BSA与柚皮素按照物质的量比1∶3混合，用200 mmol/L醋酸铵溶液稀释，蛋白最终浓度为2.5 μmol/L。

2.2 质谱进样针的制备

通过P-97毛细管拉制仪对外径为1.0 mm、内径为0.58 mm的硼硅酸毛细管进行拉制得到纳喷针，具体参数为：Heat=500，Pull=0，VEL=35，TIME=250。

2.3 非变性质谱分析

用移液枪吸取3 μL蛋白复合物溶液，推入自制纳喷针中，插入导电铂丝，上样，经质谱仪分析。根据蛋白复合物信号的强弱及分辨率，选择合适的仪器参数。主要参数如下：纳升电喷雾离子源 (nESI)，正离子模式，毛细管电压(capillary voltage)1.0 kV，锥孔电压100 V，源偏移(source offset)80 V，源温度37 ℃，捕获气体流速3 mL/min，详细参数列于表1。

表1 详细仪器参数Table 1 Detailed instrument parameters

2.4 数据处理

采用Waters公司的Masslynx V4.1和MaxEnt软件进行数据处理。

3 结果与讨论

3.1 质谱条件优化

本研究系统地考察了关键仪器参数对BSA-柚皮素复合物测定的影响，发现锥孔电压、源温度以及捕获气体流速对复合物的测定具有显著影响。

通过考察不同锥孔电压的测定结果，发现在一定范围内，随着锥孔电压的升高，蛋白及其复合物峰的分辨率越来越高，示于图2。当锥孔电压为20、60 V时，由于溶剂化效应的影响，蛋白复合物与溶液中的醋酸铵等形成非特异性加合物，质谱峰右移，图谱分辨率低；当锥孔电压为100 V时，蛋白复合物峰的丰度及分辨率最高；当锥孔电压为140 V时，蛋白复合物发生源内裂解，其质谱峰完全消失。因此，选择100 V作为最佳锥孔电压。

注：P表示BSA；PL表示BSA-柚皮素复合物图2 不同锥孔电压下的BSA-柚皮素复合物质谱图Fig.2 Mass spectra of BSA-naringenin complex under different sample cone voltages

本实验分别考察了37、80、120 ℃时蛋白复合物的丰度，结果示于图3。37 ℃时，蛋白复合物的丰度最高，随着温度升高，蛋白复合物的丰度逐渐降低，说明源温度对BSA-柚皮素复合物的影响较大，可能是高温容易使蛋白发生去折叠[16]，从而导致小分子从结合口袋脱落。因此，选择37 ℃作为最佳源温度。

图3 不同源温度下的BSA-柚皮素复合物质谱图Fig.3 Mass spectra of BSA-naringenin complex under different source temperatures

实验进一步考察了捕获气体流速对蛋白及其复合物分辨率的影响，结果示于图4。可见，当捕获气体流速为0 mL/min时，蛋白及其复合物峰的分辨率较低，谱图不平滑；当捕获气体流速为3 mL/min时，分辨率显著提高；当捕获气体流速超过3 mL/min时，分辨率未见显著变化。因此，选择3 mL/min作为最佳的捕获气体流速。

图4 不同捕获气体流速下的BSA-柚皮素复合物质谱图Fig.4 Mass spectra of BSA-naringenin complex under different flow rates of trap gas

3.2 BSA复合物的ESI-MS分析

空白BSA和物质的量比1∶3的BSA-柚皮素复合物的质谱图示于图5a，其中m/z3 908、4 153、4 430和4 746处的峰分别代表BSA的+17、+16、+15和+14电荷态，表明BSA处于天然折叠状态[10]。此外，m/z3 924、4 170、4 448和4 766处的峰分别代表BSA-柚皮素1∶1复合物的+17、+16、+15和+14电荷态；m/z4 187与4 466处的峰分别代表BSA-柚皮素1∶2复合物的+16与+15电荷态。进一步对BSA及BSA-柚皮素复合物进行去卷积处理，得到的分子质量信息示于图5b，其中66 432 u为BSA的平均分子质量，66 705 u和66 977 u分别代表化学计量比1∶1和1∶2的BSA-柚皮素复合物的平均分子质量。

图5 BSA与BSA-柚皮素复合物的多电荷(a)和去卷积(b)质谱图Fig.5 ESI-MS spectra of multiply charged (a) and deconvoluted (b) of BSA and BSA-naringenin complex

为了确定柚皮素与BSA 的相互作用方式，向BSA-柚皮素复合物溶液中加入等体积的甲醇以及1%甲酸，诱导BSA复合物发生去折叠(变性)。结果表明，分子质量为66 705 u和66 977 u的BSA-柚皮素复合物峰完全消失，仅剩分子质量为66 430 u的BSA峰，说明柚皮素是以非共价方式与BSA发生相互作用，示于图6。

图6 BSA-柚皮素复合物去折叠后的质谱图Fig.6 Mass spectrum of BSA-naringenin complex after unfolding

3.3 平衡解离常数

通过直接ESI-MS法测定BSA-柚皮素复合物的平衡解离常数(Kd)，该方法是基于电喷雾电离过程中将蛋白质溶液转化为气相离子，当配体与蛋白质相比足够小时，配体结合蛋白的大小和表面特性与游离蛋白相似，因此，气相中测定的离子丰度比可以代表平衡浓度比[17-18]。参照公式(1)～(4)可计算Kd1和Kd2，其中，[P0]表示蛋白总浓度，[P]表示游离蛋白浓度，[PL1]、[PL2]分别表示1∶1和1∶2蛋白-配体复合物浓度，R为蛋白-配体复合物与游离蛋白浓度比，[L0]表示小分子总浓度，∑IP表示游离蛋白总丰度，∑IPL1、∑IPL2表示配体结合蛋白总丰度。

(1)

(2)

(3)

(4)

使用上述方法计算化学计量比1∶1和1∶2的 BSA-柚皮素复合物的Kd1和Kd2。结果显示，Kd1为(7.82±0.03) μmol/L，Kd2为(9.63±0.02) μmol/L，与基于荧光光谱法测得的Kd值(7.46[19]、19.17[5]μmol/L)一致，说明该方法准确、可靠。

3.4 结合动力学

将BSA与柚皮素分别混合5、10、20、40 min，经质谱分析，结果显示：孵育不同时间，蛋白复合物与游离蛋白的丰度比未见显著变化，说明柚皮素与BSA形成非共价复合物的速度非常快，5 min内基本达到饱和，示于图7。

图7 BSA与柚皮素孵育不同时间的质谱图Fig.7 Mass spectra of BSA and naringenin incubated under different time

4 结论

本研究基于非变性质谱法考察了BSA与柚皮素的相互作用，结果表明，BSA与柚皮素形成了非共价复合物且亲和力较强，其化学计量比为1∶1和1∶2。结合动力学结果显示，柚皮素与BSA形成非共价复合物的速度非常快。该方法具有无需标记、样品消耗量小、简便快速、灵敏等优点，可为其他药物和血清白蛋白的相互作用研究提供参考。