血清NF-κB水平及其信号传导通路基因多态性与PPROM合并HCA的相关性研究*

刘泽滨，郑晓文，王云霞，邱丽影

广东省深圳市福田区妇幼保健院检验科，广东深圳 518000

胎膜早破(PROM)是指在未临产前发生胎膜破裂，是妊娠中晚期较为常见的并发症，我国的PROM发病率为3%～10%[1]，研究发现早产与PROM的发生密切相关，约有30%～40%早产是由于PROM所诱发[2]，其中37周之前发生PROM的临床称为未足月胎膜早破(PPROM)[3]。既往的研究表明PPROM的发生与感染密切相关，且两者互为因果[4]。绒毛膜羊膜炎(HCA) 是一种宫内感染，也是导致早产的原因之一[5]。胎膜起到保护胎儿避免感染的作用，然而在PPROM发生时由于胎膜破裂导致细菌的进入，在待产过程中容易发生HCA；且PPROM合并HCA时症状较为隐匿不易被发觉，临床易于忽视而错过最佳治疗时间，PPROM合并HCA如果治疗不及时可导致孕妇难产及新生儿感染概率增加[6]，因此及早地判断PPROM是否合并HCA对妊娠结局有着重要意义。既往研究发现，炎症的产生依赖于细胞因子的介导，核转录因子-κB(NF-κB)是一种重要的转录因子，在人体内调节与免疫和炎症相关的基因，在人体的生理病理中起着重要作用[7]。有研究表明，在分娩和炎症刺激作用下，NF-κB在胎膜组织中表达升高并进一步促进炎症因子及趋化因子的释放而加重感染[8]。研究表明NF-κB基因多态性与自身免疫性疾病及炎性疾病发病相关[9]，并有研究进一步发现NF-κB传导通路上部分位点基因变异，如NF-κB(-94ins/del ATTG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，G-308A)、一氧化氮合酶(iNOS，C608T)、环氧化酶-2(COX-2，T8473C) 等与炎症和肿瘤的发生、发展相关[10]。目前关于NF-κB传导通路基因多态性与PPROM合并HCA的相关性研究少见，本文旨在通过相关性研究，探讨其在预测PPROM合并HCA 发生的价值，并为PPROM合并HCA的早期临床诊断、治疗及预后判断提供有价值的试验依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院妇产科2018年1月至2020年1月收治的PPROM患者78例进行前瞻性研究，根据产后胎膜胎盘是否合并HCA分组，将PPROM合并HCA 32例作为观察组，单纯PPROM患者46例作为对照组。纳入标准：(1)符合第9版《妇产科学》中PPROM的诊断标准[11]；(2)PPROM 患者使用抗菌药物之前或未使用抗菌药物；(3)HCA参照第9版《妇产科学》中HCA的诊断标准[11]；(4)均为单胎妊娠且孕妇身体健康；(5)孕妇临床资料完整，能积极配合完成本研究。排除标准：(1)妊娠期间发生感染性疾病；(2)多胎妊娠；(3)有乙肝、丙肝病毒感染；(4)合并糖尿病或慢性肾脏病；(5)合并心血管系统疾病、内分泌系统疾病及风湿性疾病等；(6)合并恶性肿瘤。两组患者一般临床资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。所有患者均已签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

表1 观察组与对照组一般临床资料比较

1.2方法

1.2.1NF-κB及其他炎症因子的检测 在孕妇入院后临产前采集静脉血5 mL，将所采集的血液标本贮存于乙二胺四乙酸无菌管中，运用离心机进行红细胞和血清分离，将分离出的血清加入40 μL含蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲溶液。运用酶联免疫吸附试验对血清中的NF-κB、C反应蛋白(CRP)、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)水平进行测定，上述试剂盒均来源于上海酶联生物有限公司。检测过程严格按试剂盒说明书进行操作。

1.2.2NF-κB传导通路基因多态性的测定 在孕妇入院后临产前采集静脉血5 mL，将所采集的血液标本贮存于乙二胺四乙酸无菌管中，运用离心机进行红细胞和血清分离，吸取中间层多核细胞，保存于-80 ℃的冰箱中待测。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测NF-κB传导通路上的NF-κB(-94ins/del ATTG)、TNF-α(G-308A)、iNOS(C608T)、COX-2(T8473C) 位点的基因多态性，上述试剂盒均来源于上海生工公司。检测过程严格按试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1观察组与对照组NF-κB及炎症因子水平的比较 观察组血清NF-κB、CRP、IL-6及TNF-α水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 观察组与对照组血清NF-κB、CRP、IL-6及TNF-α水平比较

2.2NF-κB与CRP、TNF-α及IL-6相关性分析 观察组中NF-κB与CRP、TNF-α、IL-6水平均呈正相关(r=0.53、0.48、0.64，P<0.05)。

2.3观察组与对照组NF-κB(-94ins/del ATTG)基因多态性分析 观察组中NF-κB(-94ins/del ATTG)基因型以DD型为主，而对照组以II型为主，经比较两组NF-κB(-94ins/del ATTG)II、DD基因型及I、D等位基因分布差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3及图1。

2.4观察组与对照组TNF-α(G-308A)基因多态性分析 两组患者TNF-α(G-308A)基因型及等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.5观察组与对照组iNOS(C608T)基因多态性分析 两组患者iNOS(C608T)基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。

2.6观察组与对照组COX-2(T8473C)基因多态性分析 两组患者COX-2(T8473C) 基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表3 观察组与对照组NF-κB(-94ins/del ATTG)基因型及等位基因分布比较(n)

图1 NF-κB(-94ins/del ATTG )基因多态性测序图

表4 观察组与对照组TNF-α(G-308A)基因型及等位基因分布比较(n)

表5 观察组与对照组iNOS(C608T)基因型及等位基因分布比较(n)

表6 观察组与对照组COX-2(T8473C)基因型及等位基因分布比较(n)

3 讨 论

PROM是产科较常见的并发症。PROM的发生涉及多种因素，病因及病理生理学过程复杂，与宫内感染、炎症介质释放及胎膜细胞外基质降解等因素相关[12]。PROM的发生可致围生期母婴的发病率及死亡率上升，严重威胁母婴健康。因此，预防PROM的发生和早期诊断是产科研究的重要课题之一。在正常状态下，NF-κB主要位于细胞质内，与抑制性蛋白(IκB)相结合处于失活状态。当机体受到如炎症介质及细菌、病毒等刺激后NF-κB可向细胞核转移，在经典或非经典路径使得NF-κB活化，促进多种靶基因的表达，在细胞黏附、凋亡、炎性反应等方面发挥重要作用[13]，并对机体的免疫和炎性反应起调控作用，促进炎症因子如CRP、TNF-α、IL-6等释放入血[14]。本文研究结果显示，观察组患者血清中NF-κB、CRP、TNF-α及IL-6水平均明显高于对照组患者，差异均有统计学意义(P<0.05)；且观察组患者NF-κB与CRP、TNF-α及IL-6均呈正相关(P<0.05)。这可能是促炎因子(如TNF-α、IL-6等)通过NF-κB途径使胎膜合成和分泌前列腺素，进而引起子宫收缩、诱发宫颈成熟，造成早产，直接诱导胎膜细胞凋亡，降低胎膜张力，导致胎膜脆性增加从而引起胎膜早破，推测NF-κB可能参与了PPROM合并HCA的发生。

既往有研究表明，监测PPROM患者血清中的NF-κB水平对发生HCA有一定的预测价值[15-17]，作用机制可能与NF-κB 传导通路上的生物活性物质具有基因多态性，其可影响多肽链中氨基酸的排列顺序，进而改变蛋白的生物活性和功能，促进炎症细胞的分泌相关[17]。且近年来的研究也表明，NF-κB基因多态性与亚洲人自身免疫性疾病及慢性炎性疾病的发病密切相关[18]，在紫癜性肾炎的发生、发展中同样起着重要作用[19]，因此本研究团队进一步研究了NF-κB相关信号通路基因多态性与PPROM合并HCA的相关性。本研究结果发现，观察组患者血中NF-κB水平明显升高，且观察组NF-κB(-94ins/del ATTG)DD基因型出现频数明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示检测PPROM合并HCA患者血清NF-κB 水平及进行NF-κB(-94ins/del ATTG)基因多态性分析可能为预测PPROM合并HCA的发生提供具有临床价值的试验依据。但本研究结果显示，TNF-α(G-308A)、iNOS(C608T)、COX-2(T8473C)位点基因型及等位基因的出现频数在两组患者中差异均无统计学意义(P>0.05)，与既往的研究中显示TNF-α(G-308A)、iNOS(C608T)、COX-2(T8473C)位点基因型及等位基因出现频率在子宫内膜疾病及紫癜性肾炎中存在差异不同[19-21]。这可能是由于本研究中纳入的样本量较少且为单中心研究，尚不能完全说明上述3个基因多态性与PPROM合并HCA的发生不存在相关性，需要进一步研究。

NF-κB在PPROM合并HCA患者血清中高表达，且基因多态性分析显示单纯PPROM与合并HCA的PPROM患者NF-κB(-94ins/del ATTG)位点基因型明显不同，这可能是引起PPROM合并HCA患者胎膜早破导致胎膜完整性受损的因素之一，通过结合CRP、TNF-α及IL-6等多种炎症因子进行检测可能为临床预测PPROM合并HCA的发生、早期诊断、治疗及预后判断提供有价值的试验依据，这对保障孕产妇及新生儿安全具有重要临床意义。