CTC、ECT2、miR-411在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究*

薛庆丽，李延玲，郭瑞霞

河北省邯郸市人民医院呼吸内科，河北邯郸 056601

肺癌是成人中最常见的呼吸系统恶性肿瘤，据中国临床肿瘤学会(CSCO) 2020年统计，肺癌新增病例数和死亡人数仍然是处于高速增长状态[1]。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，约占肺癌总数的85%。大多数肺癌患者在首次确诊时已经处于疾病晚期，失去手术的机会[2]。早发现、早治疗仍然是提高肺癌患者远期生存的关键。黄祥奇等[3]研究得出，循环肿瘤细胞(CTC)在非小细胞肺癌中的检出率较高，并且与临床病理有一定关系，可为非小细胞肺癌筛查提供一种参考手段，也可作为临床分期的一个潜在附加指标。CTC是指自发地或因医源性原因存在于外周血液中的肿瘤细胞[4]。朱洪斌等[5]研究结果显示，上皮细胞转化序列2(ECT2)通过改变组织架构激活肿瘤通道和DNA损坏参与肿瘤进程。ECT2已被证实在多种恶性肿瘤中表达异常，如胃癌、乳腺癌、骨癌等，但是，其在肺癌患者血液中的表达情况及与患者临床病理资料之间的关系尚未阐明。ECT2主要参与鸟嘌呤核苷酸交换，诱导细胞有丝分裂和增殖[6]。谢景臣等[7]研究表明，微小核糖核酸-411(miR-411)表达在肺癌中显著上调，通过生存分析，他们发现具有较高miR-411表达水平的患者与较差的总体存活率相关。此外，姜贻乾等[8]研究表明，miR-411的表达通过靶向肿瘤抑制基因FOXOI促进肺癌的细胞增殖。目前临床中鲜见CTC、ECT2、miR-411联合检测诊断非小细胞肺癌的相关研究，所以本研究旨在探讨非小细胞肺癌患者CTC及肺癌组织中ECT2、miR-411的表达及各指标的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2020年2月至2021年2月在本院进行肺切除术的非小细胞肺癌患者53例。53例非小细胞肺癌患者中男28例， 女25例；年龄22～79岁，平均(49.89±9.70)岁；有吸烟史33例，无吸烟史20例；病程0.8～3.0年；体质量指数(BMI)19～27 kg/m2；病理分期:按国际TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期19例，Ⅲ期13例；肿瘤最大径：≤ 2 cm 28例，>2 cm 25例；伴有淋巴结转移 32例，无淋巴结转移21 例。全部非小细胞肺癌患者病例均经病理证实，并且有细胞学诊断和影像学诊断证明。选择同期在本院进行气管镜活检或者CT引导穿刺术诊断为肺良性病变的患者52例。52例肺良性病变患者中男 29例， 女23例；年龄23～80岁，平均(52.57±12.20)岁；病程0.7～3.0年；BMI 20～27 kg/m2；有吸烟史33例，无吸烟史19例；结核瘤29例，炎性假瘤17例，机化肺炎6例。非小细胞肺癌和肺良性病变患者的性别、年龄、病程、BMI、吸烟情况差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。本研究所有患者及其家属均知情同意。本研究经过本院伦理委员会批准。

纳入标准：(1)非小细胞肺癌符合《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》[9]中相关诊断标准，且病理及临床诊断为非小细胞肺癌；(2)肺良性病变通过气管镜活检或CT引导穿刺术等病理及临床诊断排除恶性肿瘤；(3)气管镜活检、CT引导穿刺术或者手术前未接受任何放射治疗和化学治疗。

排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)精神异常；(3)妊娠期、哺乳期女性；(4)进行肺癌切除手术前接受放射治疗、化学治疗以及生物学疗法。

1.2方法

1.2.1采集肺组织 非小细胞肺癌患者均接受肺癌切除术治疗，术中标本离体后，横切肿瘤组织，分别取 1 cm×1 cm× 1 cm 的癌中心组织，以及距离肿瘤边缘 5 cm 以上的离体癌旁正常肺组织(1 cm×1 cm×1 cm)。组织切取后放入液氮中冷冻并一直保存在液氮中待用。肺良性病变患者通过气管镜活检，CT引导穿刺术取的标本后也放入液氮中冷冻并一直保存在液氮中待用。

1.2.2荧光定量PCR检测miR-411表达量 分别取0.1 cm×0.1 cm非小细胞肺癌组织标本及其配对的癌旁组织和肺良性病变肺组织在组织匀浆器研碎后，利用Trizol提取RNA的方法分别提取3种组织标本的总RNA，利用酶标仪(Beckman公司生产)测定其水平。将总RNA按反转录试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司生产)说明书反转为 cDNA。反转录反应条件：30 ℃ 20 min，35 ℃ 30 min，75 ℃ 10 min。使用Primer 5.0软件设计引物。正向引物序列为5′-UAGUAGACCGUAUAGCGUACG-3′，反向引物序列为5′-GAACTGCGTGGAGCTCCACCTT-3′，内参为U6序列。利用荧光定量PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司生产)，设置扩增条件:95 ℃ 30 s、85 ℃ 35 s、75 ℃ 20 s,40个循环，分析各样品的循环阈值(Ct值)；其余步骤按试剂盒说明书[miRcute 增强型miRNA荧光定量检测试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司生产]进行操作。采用2-ΔΔCt方法计算miR-411的相对表达量。

1.2.3免疫印迹技术检测ECT2表达量 分别取非小细胞肺癌组织及其配对的癌旁组织和肺良性病变组织在匀浆器研碎，利用蛋白提取试剂盒(Solarbio)提取各个组织的总蛋白，并将总蛋白溶于SDS凝胶加样缓冲液，4 ℃，13 000×g离心15 min，取上清液作为上样样品，同时以β-actin作为内参样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后，取出凝胶并用转膜缓冲液平衡3次。通过转膜仪将凝胶中的蛋白质转移到NC膜上，转染完成后将NC膜放入膜染色液中50 s后，在50%甲醇中脱色，然后用双蒸水洗，保存，与显色结果作对比。被转印到膜上的靶抗原与抗体反应、与酶标第二抗体反应，用酶相应的蛋白信号进行检测，具体步骤按照说明书进行操作。然后分析ECT2在各肺组织中的表达量。

1.2.4CTC测定 分别采集非小细胞肺癌患者和肺良性病变患者的外周血 10 mL，将其置于专门的CTC采集管中，并进行标记。将 7.5 mL血液标本加入 Cell Tracks Auto Prep 锥形管当中，继续加入 6.5 mL 稀释的1×hCTC缓冲液，均匀摇晃后进行离心操作。CTC检测试剂盒购自赛特公司，严格按照试剂盒说明书检测CTC。

2 结 果

2.1miR-411、ECT2在不同肺组织中表达水平的比较 非小细胞肺癌组织miR-411、ECT2表达水平均高于癌旁组织、肺良性病变肺组织(P<0.05)。癌旁组织miR-411、ECT2表达水平均低于肺良性病变肺组织(P<0.05)。见表1。

表1 miR-411、ECT2在不同肺组织中表达水平的比较

2.2CTC在非小细胞肺癌患者和肺良性病变患者血液中的数量 53例非小细胞肺癌患者每7.5 mL血液CTC数量为(7.90±0.64)个，明显高于肺良性病变患者的(1.00±0.73)个,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3CTC及肺组织miR-411、ECT2水平在不同临床病理特征的非小细胞肺癌患者中的差异 不同性别、年龄(≤50、>50岁)、肿瘤最大径(≤2 cm、>2 cm)的非小细胞肺癌患者CTC数量及肺癌组织miR-411、ECT2表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。临床分期Ⅲ期的非小细胞肺癌患者CTC数量及肺癌组织miR-411、ECT2表达水平均高于临床分期Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)；低分化非小细胞肺癌患者CTC数量及肺癌组织miR-411、ECT2表达水平均低于高分化患者(P<0.05)；有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者CTC数量及肺癌组织miR-411、ECT2表达水平均高于无淋巴结转移的非小细胞肺癌患者(P<0.05)。见表2。

2.4miR-411、ECT2、CTC对非小细胞肺癌的诊断价值 ROC曲线分析显示，CTC、ECT2、miR-411单项及联合检测诊断非小细胞肺癌的曲线下面积(AUC)分别为0.542、0.531、0.589、0.748。见表3。

表2 miR-411、ECT2及CTC在不同临床病理特征的非小细胞肺癌患者中的表达

续表2 miR-411、ECT2及CTC在不同临床病理特征的非小细胞肺癌患者中的表达

表3 miR-411、ECT2、CTC诊断非小细胞肺癌的效能分析

2.5非小细胞肺癌患者CTC与肺癌组织miR-411、ECT2水平的相关性分析 结果显示，CTC与肺癌组织ECT2水平呈正相关(r=0.773，P=0.001)；肺癌组织miR-411与ECT2水平呈正相关(r=0.779，P=0.001)；CTC与肺癌组织miR-411水平呈正相关(r=0.667，P=0.001)。

3 讨 论

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位[10]。引起非小细胞肺癌的主要因素有吸烟(最重要的高危因素)、职业环境(长期处在工业废气中易引起)、电离辐射、既往肺部慢性感染(如肺结核、支气管扩张，但是较为少见)、遗传因素(家族聚集、遗传易感性以及免疫功能降低，代谢、内分泌失调等均有可能)、大气污染(石油、煤、内燃机等燃烧产生的有毒物质)[11]。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，按照组织病理学分型主要为腺癌和鳞癌，但是患者在确诊的时候大多已经是晚期，失去了手术的最佳时期[12]。

CTC是从肿瘤组织中脱离出来的肿瘤细胞，通过血管内壁进入血液循环，进行远处播散和转移[13]。近年的多项研究表明，干细胞特性的CTC具有上皮-间质转化(EMT)的能力，是肝癌、乳腺癌、结直肠、肺癌等恶性肿瘤复发转移的主要始动因素，在临床分期中具有潜在应用价值，可预测多种实体瘤的预后[14-15]。本研究显示，非小细胞肺癌患者CTC数量明显高于肺良性病变患者。非小细胞肺癌患者CTC数量与患者的临床分期、分化程度、淋巴转移有关。临床分期高、分化程度低的非小细胞肺癌患者CTC数量高于临床分期低、分化程度高的患者，有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者CTC数量高于无淋巴结转移的患者，CTC诊断非小细胞肺癌的AUC为0.589，可以作为诊断非小细胞肺癌的指标。

ECT2蛋白C端含有2个结构域，即具有催化活性的DH结构域和行使功能的PH结构域[16]。研究表明，ECT2是一种鸟嘌呤核苷酸解离交换因子(RhoGEF)，能促进结合状态的GDP解离以及GTP对CDP的替换，从而激活细胞信号转导通路的Ras相似物CTP酶，影响恶性转型以及肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等方面[17-18]。本研究结果显示，非小细胞肺癌患者肺癌组织中ECT2水平高于其配对的癌旁组织和肺良性病变肺组织中的ECT2水平。ECT2水平与非小细胞肺癌患者临床分期有关，临床分期高的患者ECT2水平高于临床分期低的患者。同样，ECT2在非小细胞肺癌组织中的水平在不同分化程度、淋巴是否转移的非小细胞肺癌患者中有差异。分化程度低、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者肺癌组织 ECT2表达水平高于分化程度高、无淋巴结转移的患者。

miRNA在细胞发育、分化、增殖和凋亡起着重要作用，miRNA可作为肿瘤抑癌基因，亦可作为肿瘤启动子[19]。本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中miR-411水平高于其配对癌旁组织和肺良性病变肺组织，在不同临床分期、不同分化程度、是否淋巴结转移的非小细胞肺癌患者中存在差异。ROC曲线分析显示，miR-411 可用于非小细胞肺癌的诊断。miR-411参与了非小细胞肺癌的发生、发展过程，可以作为临床血清肿瘤标志物[20]。

综上所述，miR-411、ECT2在非小细胞肺癌组织中的水平均高于其配对癌旁组织和肺良性病变肺组织，非小细胞肺癌患者CTC数量明显高于肺良性病变患者，CTC及非小细胞肺癌组织中miR-411、ECT2水平在不同临床分期、不同分化程度、是否淋巴转移的患者中有差异，本研究为临床非小细胞肺癌早期诊断提供临床依据。但是本研究样本量较少，还需进一步研究。