丙泊酚通过调节脊柱GluN2B-p38MAPK/EPAC1通路减轻大鼠术后疼痛

韩秋霞 齐芳 杜洪印

(天津医科大学一中心临床学院 天津市第一中心医院麻醉科，天津 300000)

10%～50%患者术后持续疼痛，而丙泊酚是一种常用的全身麻醉药，用于全身麻醉的诱导和维持，可减少术后急性疼痛〔1，2〕。丙泊酚作为辅助镇痛药的使用仍存在争议，其在术后镇痛中的潜在机制也大多未知〔3〕。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体广泛表达于中枢神经系统，在中枢敏化的产生和维持中发挥重要作用，引起痛觉过敏和异位痛的发展〔4〕。NMDA受体包括GluN1和GluN2亚基，后者包括4种类型亚基：GluN2A、2B、2C和2D。GluN2B亚基主要表达于脊髓背角的椎板Ⅰ突触，在伤害性信号传递中起关键作用〔5〕。研究报道，足底切口诱导p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化(p-p38MAPK)可增加背根神经节(DRGs)中由环磷酸腺苷(cAMP)结合蛋白(EPAC)直接激活的交换蛋白表达，从而促进伤害性超敏反应的发生〔6〕。EPAC是一种新发现的cAMP靶蛋白，作为必要的效应蛋白，在炎症和术后痛觉过敏的发展中起着关键作用。足底注射EPAC激动剂可引起长期机械性痛觉过敏〔7〕。研究证实术中p-p38MAPK的抑制不仅阻止神经元EPAC的表达和EPAC诱导的痛觉感受器敏化，还可阻断亚急性术后疼痛敏感的发展〔8〕。p38MAPK激活导致神经元EPAC表达增加是导致足底切口或炎症后长期伤害性超敏反应的关键因素〔9〕。在术后痛觉过敏中是否激活p38MAPK/EPAC级联的上游分子仍未可知〔10，11〕。本研究探究丙泊酚对手术切口后脊髓背角神经元p38MAPK/EPAC通路的调节作用，以期进一步了解丙泊酚对术后疼痛的镇痛机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 成年雄性SD大鼠，体重250～300 g，12 h亮/暗循环，关在笼子里，自由摄食和饮水。

1.2实验方法

1.2.1分组 将大鼠随机分为3组，空白组(未治疗，n=15)、异氟烷组(足底切口全麻，吸入2.5%异氟烷，n=15)、丙泊酚组〔接受足底切口全身麻醉，通过植入导管静脉输注丙泊酚至侧尾静脉，输注率为1.5 mg/(kg·min)，n=15〕。根据《动物与人剂量转换指南》，用于动物的丙泊酚剂量相当于维持全身麻醉所需的人体剂量0.2 mg/(kg·min)。异氟烷组或丙泊酚组全身麻醉30 min，足底切口全麻。足底切口后允许30 min恢复，所有大鼠符合恢复标准(即恢复直立反射)。由不参与提供全身麻醉和进行足底切口的研究助理(即对全身麻醉类型盲法)在种植切口前和术后72 h测量对侧和同侧爪子的机械关节痛。

1.2.2术后急性疼痛模型的建立 通过足底切口手术建立术后疼痛模型。在异氟烷或丙泊酚的全身麻醉下，用10%聚维酮碘溶液和75%乙醇消毒右后爪的足底。用11号刀片作1 cm纵行切口，从距骨末端0.5 cm处开始，一直延伸至足趾，穿过脚掌的皮肤和筋膜。将跖肌挑出并纵向切开，之后借助无菌纱布擦拭肌肉切口位置直至出血停止，缝合大鼠皮肤(借助5-0尼龙线)。术后将大鼠置于恒温笼中30 min恢复。

1.2.3机械性疼痛的评估 通过测量机械刺激缩足阈值(动物对无害机械刺激的反应)评估机械对抗痛。实验前将大鼠置于提前准备好的金属测试网上30 min以适应环境。在评估过程中，一根von Frey纤维(4.31)以连续的力垂直压在后腿足底表面的中心，力度至纤维大致弯曲为S形即可。大鼠在3～5 s内因刺激而快速缩足或舔爪则被记为阳性。若大鼠无反应则采用递增的von Frey纤维进行刺激。每只大鼠重复评估9次，间隔约5 min。多次重复的平均值作为最终的机械刺激缩足阈值。

1.2.4Western印迹 术后1 h收集L3～L5节段腰椎背角组织。加入组织裂解液并在冰上研磨组织，之后将组织匀浆置于EP管，3 000 r/min离心15 min，收集上清液，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。之后将上样缓冲液加入蛋白，沸水煮10 min，每孔上样40 μg。之后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗pan-GluN2B、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、p38 MAPK、JNK、Epac1/2及对应磷酸化蛋白抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等，孵育过夜。第2天磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后将膜与二抗山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)在室温下孵育1 h。增强化学发光孵育后，X线片显示蛋白条带。用ImageJ软件分析条带的灰度值。

1.2.5免疫荧光染色 戊巴比妥钠麻醉大鼠，4%多聚甲醛经心血管系统灌注。收集腰椎节段L3～5，置于-80℃保存。之后将组织包埋，截取脊髓组织横断面。PBS冲洗组织，3%山羊血清在室温下封闭1 h，之后将封闭液丢弃，加入一抗兔抗c-Fos(1∶100，Abcam，剑桥，英国)，4℃孵育过夜。PBS洗涤后，切片用荧光标记的二抗孵育。二抗孵育结束后PBS清洗，晾干、封片，之后置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.3统计学方法 采用GraphPad Prism8.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1丙泊酚能改善足底切口引起的机械性疼痛 足底切口可引起大鼠机械性痛觉敏感。除空白组外，丙泊酚组和异氟烷组的机械刺激缩足阈值在2 h后显著降低，之后随时间递增上涨，而丙泊酚组机械刺激缩足阈值均显著低于异氟烷组(均P<0.05)。见表1。提示相对于异氟烷，丙泊酚能显著改善由足底切口导致的机械性疼痛。

2.2丙泊酚可抑制足底切口痛模型大鼠脊髓中GluN2B/p-38 MAPK/EPAC1通路相关因子的蛋白表达 与空白组比较，异氟烷组和丙泊酚组p-GluN2B/GluN2B、p-p38/p-38、p-ERK/ERK及p-JNK/JNK表达显著增加(均P<0.05)。与异氟烷组比较，丙泊酚组p-GluN2B/GluN2B、p-p38/p-38、p-ERK/ERK及p-JNK/JNK表达显著降低(均P<0.05)。见表2。

2.3丙泊酚抑制足底切口痛模型大鼠脊髓c-Fos的表达 免疫荧光检测结果显示，与空白组相比，异氟烷组和丙泊酚组脊髓背角段(L3～L5)c～Fos阳性表达显著增强(均P<0.05)。相对于异氟烷组，丙泊酚组在脊髓背角Ⅰ层表达显著被抑制(P<0.05)，在Ⅲ～Ⅴ层的阳性细胞数目不存在统计学差异(P>0.05)。表明丙泊酚选择性地抑制了足底切口痛模型大鼠腰椎背角内的伤害性信号传递。见图1、表3。

图1 各组c-foss阳性细胞在脊髓背角的分布(免疫荧光染色，×400)

表3 各组c-Fos阳性细胞在脊髓背角的分布层)

3 讨 论

据报道，在海马神经元中，GluN2B是丙泊酚抑制NMDA受体激活，通过缓慢的钙离子通道调节Ca2+内流的靶点之一〔12，13〕。研究报道，丙泊酚通过下调GluN2B亚基表达在体内抑制锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫持续状态〔14，15〕。然而，关于丙泊酚对脊髓神经元的影响的信息相当有限〔16〕。本研究证实了在动物术后疼痛模型中，脊髓NMDA受体GluN2B亚基是静脉输注丙泊酚进而减少机械疼痛的重要靶点。然而，丙泊酚是否通过直接与NMDA受体结合或间接绕行对GluN2B产生抑制作用仍有待进一步探讨〔17〕。

神经元中，钙离子通过NMDA受体进而导致MAPK通路激活，脊髓MAPKs的磷酸化，如p38和ERK1/2，参与急性术后疼痛模型中机械超敏反应的发生和维持〔18〕。研究表明，在足底切开后1～3 d，脊髓背侧神经元和小胶质细胞中p38 MAPK的磷酸化均有增加，在足底切口前30 min鞘内注射p38抑制剂可减轻切口引起的机械性疼痛〔19，20〕。研究表明，p38 MAPK主要由炎性细胞因子激活，手术后损伤的组织会启动一系列炎症细胞因子，这些细胞因子与术后疼痛强度呈正相关〔1〕。

综上，丙泊酚可降低动物术后疼痛反应，抑制脊髓GluN2B-p38MAPK/EPAC1信号通路。本研究证实丙泊酚对脊髓p38 MAPK/EPAC1和c-Fos的表达选择性抑制。