基于网络药理学探讨瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的作用机制

蒋先伟 马战平

(1陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2名中医马战平传承工作室；3陕西省中医医院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种临床常见的持续性、进行性的慢性气道炎症性疾病〔1〕，其主要特征为持续存在的呼吸系统症状及不可逆气流受限,其发病多与吸烟、环境污染、化学物质、职业粉尘等因素密切相关〔2〕。近年来，COPD已成为全球最严重的呼吸系统疾病之一，其新增确诊率和致死率不断攀升〔3〕，其反复发作的特性是导致COPD患者死亡率居高不下的关键，所以提高对COPD危险因素的控制及减少其急性发作次数成为现在临床中亟待解决的问题。而中医药在防治COPD上有一定优势，能够减少急性加重次数，改善患者症状及肺通气功能，提升患者生活质量〔4,5〕。

现代研究表明瓜蒌薤白半夏汤在COPD治疗上亦有其独特优势，如黄楚燕等〔6〕自拟加味瓜蒌薤白半夏汤能显著提高临床疗效,降低炎症表达,改善患者肺通气功能和凝血功能；张炳填等〔7〕发现瓜蒌薤白半夏汤可抑制COPD模型大鼠血清中白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达，减轻炎症反应，从而起到对COPD较好的治疗作用。

网络药理学可以科学地阐释中药及中药复方治疗疾病的分子机制，从而成为中医药治疗疾病多成分、多靶点、多通路的直接证据〔8〕。利用网络药理学有利于推进中医药现代化的步伐，为中药复方的临床及实验研究提供依据并指明发展方向。故本文基于网络药理学及分子对接技术，探讨瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的作用机制，为后续研究提供相关依据。

1 材料及方法

1.1瓜蒌薤白半夏汤主要化合物筛选及治疗靶点的获取 将瓜蒌、薤白、半夏三味药物输入中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中进行检索，设置口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为筛选条件，获取到符合条件的化合物；并通过平台获取化合物对应的相关靶点，以待后续进行比对。同时利用 Uniprot 数据库，对所有靶点进行标准化处理。

1.2COPD疾病靶点的获取 将“chronic obstructive pulmonary diseases”作为搜索关键词，分别在人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)、药物银行(DrugBank，https://go.drugbank.com/)及人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https://omim.org/)数据库进行检索，获得COPD疾病相关靶点，并进行比对整合去除重复。

1.3交集靶点的获取 将所获取的中药潜在治疗靶点及疾病靶点进行整合筛选后，利用R语言软件进行交集的获取并绘制韦恩图。

1.4药物-成分-靶点网络关系图的绘制 将获得的瓜蒌薤白半夏汤的主要化合物与获得的交集基因导入Cytoscape软件中进行药物-成分-靶点网络关系图的绘制。网络图中node1代表药物，node2代表靶点，edge代表不同节点间的相互关系，并根据网络度值(Degree)的大小进行分类，Degree越大，说明其在网络中作用越重要。根据其Degree筛选出网络中排名前十的关键化合物，以备后续分子对接验证。

1.5蛋白互作(PPI)网络的绘制及核心靶点的筛选 再将获得的交集基因导入到蛋白质相互作用数据库(STRING，https://string-db.org/)网络平台中，并设置最低作用阈值(>0.9)，去除游离基因，构建PPI；然后将网络导入到Cytoscape软件中利用CytoNCA插件进行核心网络的筛选。

1.6基因本体论(GO)生物学富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 利用R语言软件进行KEGG代谢通路富集分析、GO富集分析，设置P<0.05及矫正后的P<0.05为筛选条件进行分析，输出结果并绘制相应柱状图，图中纵坐标为生物过程或通路名称，横坐标代表富集在其中的基因数量，而颜色代表富集的显著性，颜色越深，代表基因在该生物过程或通路中富集显著性越强。

1.7分子对接虚拟验证 从PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获取“药物-成分-靶点”网络关系图中筛选出的度值较高化合物的小分子2D结构，将其导入Chemm Office 软件转换为3D结构，并按最小的自由能进行结构优化；利用PDB 蛋白质结构数据库(RCSB，http://www.rcsb.org/)平台PPI网络获取到的核心蛋白受体结构，并利用Pymol 软件去除水分子及小分子配体，然后导入 AutoDockTools 软件进行加氢等预处理；最后利用Vina软件进行分子对接，验证其结合活性。

2 结 果

2.1瓜蒌薤白半夏汤主要化合物及治疗靶点 在TCMSP平台中按照OB≥30%，DL≥0.18为条件筛选后共获得主要化合物35种，其中瓜蒌11个，薤白11个，半夏13个；然后将所获得的化合物与治疗靶点进行比对，获得成分靶点68个。

2.2COPD疾病靶点的获取 在GeneCards、DrugBank及OMIM中以“chronic obstructive pulmonary diseases”为关键词进行检索。其中GeneCards中将Score>1作为筛选条件，获得2 421个疾病靶点，DrugBank数据库获得206个疾病靶点，OMIM数据库获得349个；将3个数据库获得靶点进行整合，去除重复后共获得2 505个疾病靶点。

2.3交集靶点的获取 将前两项中所获得靶点进行整合筛选后，利用R语言软件进行交集靶点的获取，共获得交集靶点139个。

2.4药物-成分-靶点调控网络图 将上述获得的主要化合物与交集基因共同导入Cytoscape软件中，绘制出“药物-成分-靶点”调控网络图(图1)，并将药物成分按照Degree大小进行筛选后，获取到网络中起到主要作用的化合物(表1)，以备后续进行分子对接验证。

圆形代表药物，方形代表靶点，颜色中红色代表半夏，紫色代表薤白，橙色代表瓜蒌图1 “药物-成分-靶点”调控网络

表1 主要化合物Degree及来源

2.5PPI及核心靶点 将所获得的交集基因导入STRING网络平台中构建PPI(图2)，其中节点代表基因，连线代表蛋白互作关系，不同颜色代表不同证据。然后将网络导入到Cytoscape软件中利用CytoNCA插件进行计算网络节点的度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、网络中心性(NC)和局部边连通性(LAC)，得到上述值的中位数，小于中位数的靶点则去除。经过拓扑分析后，得出核心基因(图3)。提取核心网络中度值较高的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、JUN、MAPK1、TP53、FOS、雌激素受体α(ESR1)作为分子对接中的蛋白受体。

图2 PPI

图3 PPI核心网络

2.6GO生物学富集结果及KEGG通路富集结果 GO生物学富集分析结果(图4)显示共获得2 397条结果，其中生物过程(BP)2 112条，主要涉及细胞对药物的反应、细胞对氧化应激的反应、对金属离子的响应、对抗生素的反应、对活性氧的反应、对脂多糖的反应、对营养水平的反应、氧化应激反应和对细菌源分子的反应等；细胞组分(CC)87条，主要涉及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、突触后膜的内在成分、突触后膜的组成部分、突触前膜固有成分、质膜筏、突触前膜的组成部分、膜区、膜微区等；分子功能(MF)198条，主要涉及抗氧化活性、类固醇激素受体、泛素蛋白连接酶结合、氧化还原酶活性、配体激活的转录因子活性、核受体活性、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合等。

图4 GO生物学富集分析

KEGG富集分析结果(图5)共获得通路167条，主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、TNF通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-Akt信号通路小细胞肺癌、甲型流感、低氧诱导因子(HIF)-1信号通路、人巨细胞病毒感染、膀胱癌、前列腺癌等，提示瓜蒌薤白半夏汤可能通过上述通路起到对COPD的干预作用。

图5 KEGG通路富集分析

2.7分子对接结果 将获得的重要化合物槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素、豆甾醇、羟基芫花素分别与获得的核心靶点：MAPK3、JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1进行分子对接，其结果见表2；文献报道称，一般结合能分值≤-5.0 kCal/mol，则表示具有较好结合作用〔9〕；结果表明槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素、豆甾醇、羟基芫花素与核心基因MAPK3、JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1结合能均小于-5.0 kCal/mol，提示其具有良好的结合能力(图6)。

表2 活性化合物与核心靶点结合能

图6 药物的主要活性成分与蛋白的分子对接

3 讨 论

3.1中医对COPD的认识 COPD属于中医“肺胀、喘证”范畴，其临床主要表现为咳嗽、咯痰、气短、气喘、胸闷等症状。其主要病机则责之于虚、痰、瘀，病情日久，气耗则虚，正气亏虚，则机体气化不足，促使阴邪痰饮生成，痰饮留驻，虚实转换，更碍气机流行，则瘀血随之而生，终成虚、痰、瘀三者互相夹杂，虚实错杂之势。而痰作为其最重要的病理因素，伴随病程始终；瓜蒌薤白半夏汤作为治疗痰浊内阻的胸痹主方，其通阳散结、豁痰开胸之功用与肺胀病机不谋而合，且早在20世纪90年代，就有医家〔10〕论述COPD与胸痹的关系，认为肺胀病程中气虚、痰饮、瘀血阻于胸间亦与胸痹“阳微阴弦”的特点相符，为瓜蒌薤白半夏汤治疗肺胀提供了理论支撑。现代研究表明，瓜蒌中的氨基酸有显著祛痰功效，所含天冬氨酸也可以抑制炎症反应，从而使呼吸道分泌物减少〔11〕；薤白具有良好的解痉平喘作用,其同时具有良好的抗菌、抗氧化作用〔12～14〕；对半夏的研究表明，其具有良好的镇咳祛痰、抗菌、抗氧化抗炎作用〔15～18〕。

3.2主要化合物分析 通过对药物-成分-疾病-靶点网络图的分析得知，槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素、豆甾醇、羟基芫花素可能是瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的关键化合物。现代研究表明，COPD的发病机制与炎症、氧化应激、黏液高分泌、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、气道重塑等密切相关〔19〕。而槲皮素具有明显的抗菌、抗炎、抗氧化作用〔20～22〕，如魏萍等〔23〕研究发现，槲皮素可以有效改善COPD模型大鼠肺损伤情况，提高其肺功能水平，抑制炎症因子表达和细胞凋亡，同时能抑制转化生长因子(TGF)-β1信号通路，改善其气道重塑情况；柚皮素也具有明显的抗菌、抗炎、抗氧化、止咳祛痰功效〔24〕,如江勇等〔25〕研究发现柚皮素可抑制肺泡巨噬细胞内NLRP3炎症小体的活化，从而减轻脓毒症大鼠急性肺损伤；同时β-谷甾醇、黄芩素、豆甾醇、羟基芫花素亦有较好的抗炎、抗菌、抗氧化作用〔26～29〕。以上结果表明，瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD是多种化合物共同作用所取得的结果，表现出中药复方多成分的特性。

3.3PPI核心网络分析 通过拓扑分析后，提取出较为重要的6个靶点为MAPK3、JUN、MAPK1、TP53、FOS、ESR1。其中MAPK3、MAPK1同属于丝裂酶原活化蛋白激酶，参与细胞的分化、凋亡、增殖等过程〔30〕，有研究表明，MAPK信号通路在COPD炎症反应、黏液高分泌、气道重塑等方面发挥重要作用，是COPD治疗的重要靶点〔31,32〕，如p38 MAPK可以激活TGF-β从而达到对肺部炎症和纤维化的影响〔33,34〕。转录因子AP-1是由JUN、FOS和ATF亚基的二聚转录因子共同组成的，而JUN和FOS的转录直接关系到AP-1的活性〔35，36〕，而MAPK信号通路是激活AP-1的重要途径，其ERK、JNK、p38都可以通过JUN和FOS激活AP-1〔37〕,AP-1的激活则与肺组织在烟雾或环境因素影响下的氧化应激反应呈正相关〔38〕。TP53是一种肿瘤抑制因子，可通过调节细胞周期从而达到抑制炎症作用〔39〕，有研究发现，肺泡Ⅱ型上皮细胞被卡介苗结核分枝杆菌(BCG)感染时，P53可通过抑制TNF-α介导细胞死亡〔40〕。ESR1是雌激素受体，在不同类型的肺内均有表达，有研究表明，选用雌激素作为干预措施，可有效抑制NF-κB的转录与表达，降低内皮黏附因子表达，降低炎症因子表达，从而达到治疗COPD的效果〔41〕。由此推测，瓜蒌薤白半夏汤可能是通过上述靶点干预COPD，但尚需后期实验进行验证。

3.4GO生物学富集结果及KEGG通路富集结果分析 GO生物学富集结果主要集中在细胞对氧化应激的反应、对抗生素的反应、对活性氧的反应、对营养水平的反应、对脂多糖的反应等。其中氧化应激反应是COPD发病和发展的重要环节，研究表明，其不仅可直接导致肺部损伤，同时能够激活肺内多种炎症因子表达，促进肺内抗蛋白酶氧化失衡，增加黏液分泌〔42〕。

营养水平的下降也是COPD患者病情不断加重的重要因素，谢梅等〔43〕将576例老年COPD患者分为营养正常312例，有营养不良风险192例，营养不良72例进行观察，其结果表明营养正常组肺功能明显高于其他两组。由上可知，这些生物学过程贯穿治疗COPD的全过程，并能与通路富集结果相互验证。

KEGG通路富集结果主要集中在AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF通路、HIF-1信号通路等。结合COPD主要发病机制，笔者推测瓜蒌薤白半夏汤通过以下方面发挥治疗作用：(1)抗炎，研究表明PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF通路作为经典的炎症信号通路，与COPD密切相关。研究表明PI3K参与炎症细胞的募集和活化，并能够激活其下游的NF-κB进行转录，增强炎症的表达〔44〕；同时AGE-RAGE信号通路及HIF-1信号通路与炎症亦密切相关，研究表明二者均可以激活NF-κB，从而促使其下游炎症因子的激活〔45,46〕；(2)抗氧化应激，活性氧激活AGE-RAGE信号通路后,可激活氧化酶产生大量的活性氧,并且会进一步激活MAPK等通路使NF-κB发生磷酸化而活化,从而释放多种趋化因子、炎症因子及黏附因子如TNF-α等，导致机体的损伤〔47〕。而氧化应激同时可作用于PI3K-Akt信号通路，促使气道及肺部炎症的发生〔48〕。(3)抑制气道重塑，赵向〔49〕研究发现阿奇霉素可通过抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α/VEGF通路来改善哮喘小鼠气道重塑，证明PI3K-Akt、HIF-1信号通路与肺组织气道重塑的相关性。AGE-RAGE信号通路可以增强TGF-β1，促使TGF-β1和结缔组织生长因子表达增多，同时其尚可以刺激血管内皮生长因子(VEGF)的生成。综上所述，瓜蒌薤白半夏汤可通过上述通路发挥抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等方面作用治疗COPD，但其强弱作用仍需进一步探讨。

本研究采用网络药理学及分子对接技术探讨瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的作用机制，筛选出主要化合物为槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素、豆甾醇、羟基芫花素、松柏苷、香叶木素等，这些化合物对于多数靶标都起到干预作用，同时分子对接结果显示主要化合物与PPI核心基因结合度较好，更加验证了本次研究的结果。同时通过GO富集分析和KEGG富集分析，预测出瓜蒌薤白半夏汤可能是通过AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF通路、HIF-1信号通路及其相互作用起到抗炎、抗氧化、抑制气道重塑的作用，体现出中药复方的多通路、多靶点的特性。综上所述，本文预测出瓜蒌薤白半夏汤治疗COPD的相关化合物、通路、靶点为以后的研究提供了参考，但不足之处是只做了分子对接验证及未考虑各成分的含量及合用时成分的变化，希冀能在后期动物实验中进行完善和验证。