SDF-1a模拟物CTCE-0214对重症肺炎的治疗作用及机制

刘振峰 周国旗 陈伟 陈小英 邹丽 蔡小燕 杜作丽 杨迅 曾庆松 金成静 吴凡 张怡然

(1遵义市红花岗区人民医院呼吸与危重症医学科，贵州 遵义 563000；2贵州中医药大学)

重症肺炎(SP)是一种进展性肺部炎症，可由局部感染快速演变为全身性感染、严重脓毒症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或多器官功能障碍综合征(MODS)等〔1〕。在所有住院的肺炎患者中，SP的治疗一直是学界研究热点。近年来在治疗上虽有较大进展，但抗感染仍是治疗SP的核心内容，因此清除体内感染致病菌和抑制炎症反应对提高SP的存活率尤为重要，研发一种能够同时增强机体杀菌能力和抑制炎症反应的药物是目前治疗SP的热点〔2〕。CTCE-0214 (CTCE)是一种基质细胞衍生因子(SDF)-1a的小肽类分子模拟物，SDF-1a作为趋化因子CXC家族成员之一，在体内能够激活和募集中性粒细胞并发挥抗炎作用，然而SDF-1a在血液中的半衰期很短，这使SDF-1a在体内发挥作用有限〔3〕。CTCE在血液中较稳定并能发挥SDF-1a相似的作用。本研究采用脂多糖(LPS)诱导模型SP小鼠，通过CTCE治疗后观察小鼠肺毛细血管通透性、肺含水量、支气管肺泡灌洗液(BAL)细胞数量和BAL中炎症因子的表达水平，并探讨CTCE对SP的保护作用机制，为SP的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1实验动物和试剂 健康、雄性、CD-1小鼠(7～8周龄)，由遵义医科大学动物实验中心提供，体重(18±5)g。LPS购自Sigma-Aldrich公司；小鼠白细胞介素(IL)-6、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-2和肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；聚合酶链反应(PCR)引物购自上海生工生物科技有限公司；Trizol 购自美国Promega公司；RNA逆转录试剂盒、RNA扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司；LPS、兔抗小鼠蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、Rac1和β-actin、CTCE、SDF-1a购自Sigma-Aldrich公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自美国Abcam公司；miR-126 inhibitors购自美国Invitrogen公司。

1.2动物模型和分组 将实验动物随机分为正常对照组、LPS组、LPS+CTCE组、LPS+SDF-1α组各12只。LPS组小鼠气管内滴注LPS(5 mg/kg)，正常组小鼠气管内滴注生理盐水(5 mg/kg)，LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组在小鼠滴注LPS(5 mg/kg)2 h 后通过尾静脉注射CTCE或SDF-1α(10 mg/kg)。同时在进一步实验中将动物按照数字随机分为LPS+CTCE组、LPS+CTCE+miR-126-NC组(阴性对照)和LPS+CTCE+ miR-126 inhibitors组。在LPS(5 mg/kg)造模24 h后处死小鼠并收集肺组织和BAL。

1.3小鼠肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量 各种小鼠在干预后从股静脉以2 mg/kg剂量注射2%伊文蓝溶液，分离肺组织，以1 ml/100 mg加入甲酰胺溶液，在酶标仪620 nm处测吸光度值，计算肺组织伊文蓝的含量，以此计算小鼠肺毛细血管通透性。采用干湿重的方法测右下肺湿干重比值计算肺含水量，肺含水量=(湿重量-干重量)/(湿重量)× 100%。将BAL细胞沉淀重悬于500 μl 1×红细胞裂解缓冲液中，在600 r/min离心5 min。将细胞小丸重悬于500 μl PBS中，用血细胞计数器计数，即为BAL细胞数量。

1.4BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α测定 采用ELISA测定BAL炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平，严格按照说明书进行，并在酶标仪中测量吸光值。

1.5qRT-PCR 在不同组中，采用Trizol试剂从肺组织中提取总RNA，通过紫外分光光度仪测定OD260/280值，取用OD260/OD280比值在1.8～2.0之间的样本。采用RNA逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，然后采用RNA扩增试剂盒通过实时定量PCR扩增cDNA。GAPDH为靶基因内参，采用2-ΔΔCt方法计算靶基因的相对表达量。

1.6Westrn印迹 在不同组中，采用蛋白提取试剂盒提取肺组织中的总蛋白，然后用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度。以每孔加入50 μg的待测蛋白于十烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)-PAGE凝胶，110 V电泳后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，分别加入兔抗小鼠AKT、p-AKT、Rac1和β-actin一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37℃ 孵育1 h，TBST洗膜3×30 min，电化学发光(ECL)显影。运用Quantity one 软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作内参，计算相对表达量。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量比较 与正常对照组比较，LPS组中肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量明显增加(均P<0.05)。与LPS组比较，LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量明显减少(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+ SDF-1α组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量无明显差异(均P>0.05)。见表1。

表1 各组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量比较

2.2各组BAL中炎症因子表达水平比较 与正常对照组比较，LPS组BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平明显升高(均P<0.05)。与LPS组比较，LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平明显降低(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α表达水平无明显差异(均P>0.05)。见表2。

2.3各组miR-126、AKT、p-AKT和Rac1表达水平比较 与正常对照组比较，LPS组miR-126表达水平明显降低，p-AKT和Rac1表达水平明显升高(均P<0.05)。与LPS组比较，LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组miR-126表达水平明显升高，p-AKT和Rac1表达水平明显降低(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+SDF-1α组miR-126、p-AKT和Rac1表达水平无明显差异(均P>0.05)。AKT在各组间的表达水平无明显差异(均P>0.05)。见表2。

2.4低表达miR-126对CTCE干预SP小鼠后肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量的影响 与LPS+CTCE组和LPS+CTCE+miR-126-NC组比较，LPS+CTCE+miR-126 inhibitors组中肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量明显增加(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+CTCE+miR-126-NC组肺毛细血管通透性、肺含水量和BAL细胞数量无明显差异(均P>0.05)。见表3。

2.5低表达miR-126对CTCE干预SP小鼠后miR-126、AKT、p-AKT和Rac1表达水平的影响 与LPS+CTCE组和LPS+CTCE+miR-126-NC组比较，LPS+CTCE+miR-126 inhibitors组miR-126表达水平明显降低，p-AKT和Rac1表达水平明显升高(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+CTCE+miR-126-NC组miR-126、p-AKT和Rac1表达水平无明显差异(均P>0.05)。AKT在各组间的表达水平无明显差异(均P>0.05)。见表3。

2.6低表达miR-126对CTCE干预SP小鼠后BAL中炎症因子表达水平的影响 与LPS+CTCE组和LPS+CTCE+miR-126-NC组比较，LPS+CTCE+miR-126 inhibitors组BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平无明显升高(均P<0.05)。LPS+CTCE组和LPS+CTCE+miR-126-NC组BAL中炎症因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表达水平无明显差异(均P>0.05)。见表4。

3 讨 论

SDF-1a能通过小肽类激动剂模拟其功能，CTCE作为SDF-1a的一种多肽类模拟物，具有更好的稳定性和更长的半衰期〔4〕。CTCE的性质类似于CXCL12，在体内能够发挥多种生物学功能。研究显示，在LPS诱导的多器官功能障碍综合征中，CTCE能够明显降低IL-6和TNF-α表达水平〔5〕。同时在LPS 诱导的急性内毒素血症中，CTCE具有抗氧化、抗感染和细胞保护作用〔5〕。这体现CTCE在抑制炎症反应中发挥着重要作用。本研究结果提示CTCE和SDF-1α均能够治疗SP并抑制炎症因子，并且CTCE和SDF-1α发挥的作用未见明显差异。

miRNAs是一类非编码的小RNA，长度只有20～24 nt，在生物体基因组中普遍存在〔6〕。目前研究证实，miRNAs只占所有RNA的1.0%左右，但能够调控机体30%～50%的基因表达〔7〕。miRNAs在体内参与细胞增殖、分化、侵袭、凋亡和炎症反应等多种细胞生物学功能〔8〕。随着对miRNAs研究的深入，越来越多的证据表明，miRNAs参与SP中发挥重要作用〔9,10〕。研究显示，CTCE能够通过调控内皮祖细胞中miR-126、miR-125b、miR-34a和miR-155的表达水平抑制败血症的进展〔11〕。本研究结果提示CTCE或SDF-1α能够明显提高SP中miR-126的表达量而发挥作用。然而其作用机制尚未完全明确。

AKT是磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路中重要的转导蛋白，在细胞生长、增殖、迁移和分化中发挥重要作用〔12〕。Racl是Rho超家族主要成员中的Rac亚家族，AKT是Racl上游分子，AKT/Rac1信号通路在炎症反应中发挥着重要左右〔13,14〕。研究显示，miR-126能够通过调控AKT/Rac1信号通路参与败血症中的炎症反应〔15〕。本研究结果说明在SP中AKT/Rac1通路被激活。为分析在SP中miR-126对AKT/Rac1信号通路的调控作用，在LPS+CTCE组中加入miR-126 inhibitors进行干预，结果提示CTCE通过促进miR-126的表达水平发挥SP保护作用和抑制SP中炎症因子，miR-126能够抑制AKT/Rac1信号通路的激活。

综上，SDF-1a模拟物CTCE能够通过上调miR-126的表达来抑制AKT/Rac1信号通路，进而对SP发挥保护作用。CTCE可能成为SP治疗的重要药物。