NGF联合抗VEGF对糖尿病模型大鼠视网膜组织中氧化应激和VEGF表达的影响

孙鹏 孟岩 张剑 齐艳秀 刘宏伟

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

糖尿病是严重影响人们健康的一种慢性代谢性疾病，日益受到国内外科研工作者的广泛关注。在糖尿病所有类型中，2 型糖尿病最为多见，占所有病例的90%以上〔1〕。糖尿病眼病是由糖尿病引起的一类眼部并发症的总称，其中最典型的是糖尿病性视网膜病变(DR)，它是导致患者视力下降、受损甚至失明的主要原因〔2〕。糖尿病眼病的发病机制错综复杂，诸多血管刺激和抑制因子在其演进过程中发挥重要调节功能，血管内皮生长因子(VEGF)因其具有显著的促血管生成作用，故其在糖尿病眼病病理过程中的作用备受人们关注〔3〕。有关研究报道，在糖尿病眼病的演进过程中，可检测到VEGF表达和水平的增加，但对于糖尿病眼病的各时间段VEGF水平的具体情况没有进行深入探讨〔4〕。在糖尿病的模型制备中，目前人们主要以大鼠为研究对象，通过注射链脲佐菌素(STZ)来促使其发展为糖尿病模型〔5〕。本研究利用STZ诱导大鼠构建糖尿病模型，并利用神经生长因子(NGF)和抗VEGF进行干预后，观察大鼠血清血糖和VEGF的变化，检测大鼠视觉电生理视网膜暗反应(ERG)，并研究大鼠视网膜组织氧化应激水平和VEGF含量，以明确抗VEGF药物对糖尿病大鼠视网膜病变的防治作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用清洁级(SPF)8周龄健康雄性Wistar大鼠(体重210～250 g)80只(长春亿斯实验动物技术有限责任公司)，分笼(5只/笼)饲养。动物采用自由饮水摄食饲养，饲养条件为：空气相对湿度50%～70%，环境温度19～22℃，明暗交替光照周期为12 h/12 h。

1.2实验仪器与试剂 链佐霉素(美国Sigma公司)；水合氯醛(广州市医药公司)；VEGF一抗(武汉博士德公司)；二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥公司)；浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉金桥公司)；MP150生理记录仪(美国BioLab公司)；组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；石蜡切片机、展片机(德国Leica公司)；恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)。

1.3实验分组和模型建立 将大鼠随机平均分为正常对照组、模型组、NGF组和NGF+抗VEGF组各10只。正常对照组给予正常饮食，其他3组给予高脂高糖饮食。持续4 w后，进行造模，造模前先禁食24 h，然后模型组、NGF组和NGF+抗VEGF组腹腔注射STZ(50 mg/kg)，正常对照组则腹腔注射相同体积的柠檬酸缓冲液。造模72 h后，采集尾静脉血检测空腹血糖(FBG)，FBG≥16.7 mmol/L为模型制备成功。

1.4给药 诱导糖尿病模型后继续饲养至16 w，待模型组、NGF组和NGF+抗VEGF组出现视网膜病变后，进行如下给药处理：NGF组在肌肉和眼球玻璃体腔内分别注射NGF和生理盐水，NGF+抗VEGF组两部位分别注射NGF和抗VEGF药物，而正常对照组两部位则注射生理盐水，连续给予3 w。

1.5大鼠房水中VEGF和FBG含量检测 各组实验大鼠尾静脉取血测FBG，眼球房内取房水采用VEGF酶联免疫检测试剂盒(AE98006Ra，上海联硕生物科技有限公司)测VEGF水平。

1.6ERG检查 大鼠暗适应1 h以上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为0.3 g/kg体重。麻醉状态的大鼠固定于大鼠实验台上，右眼滴加复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)散瞳，滴加盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)表面麻醉。将记录电极、参考电极和接地电极分别与右眼角膜表面、两眼间和尾部进行连接。用MP150生理记录仪进行ERG记录，反应光强为0.38 cd·s/m2。检测结束后，点氯霉素眼药水以预防感染。

1.7视网膜组织中丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)含量检测 将实验大鼠视网膜组织进行充分研磨，并制备成10%组织匀浆液。常温进行离心(2 000 r/min)后，收集上清液，用酶联免疫检测试剂盒和可见光分光光度计测定各组视网膜组织中MDA、CAT和SOD含量变化。

1.8免疫组化检测VEGF蛋白表达 将切片进行烤片30 min；常规脱蜡、入水、抗原修复、封闭后，用抗VEGF抗体(稀释比为1∶50)在4℃孵育过夜；用二步法免疫组化检测试剂盒操作后，进行DAB显色；浸入苏木素染液5 s进行复染，然后浸入1%HCl/酒精30 s进行分化；蒸馏水彻底冲洗后，置于自来水中放置2 h；常规脱水、透明、封片后利用图像采集系统采集并分析结果。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0统计学软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组房水中VEGF水平和FBG比较 各组注射3 w后，与正常对照组相比，其余3组VEGF水平、FBG明显增高(P<0.05)；与模型组比较，NGF组和 NGF+抗VEGF组VEGF水平有统计学差异(P<0.05)，而FBG差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组房水中VEGF和FBG比较

2.2各组ERG检查 各组注射3 w后，与正常组比较，模型组、NGF组ERG检查b波潜伏期显著延迟(P<0.05)，振幅明显上升(P<0.05)；与模型组比较，NGF组和 NGF+抗VEGF组ERG检查b波潜伏期显著缩短(P<0.05)，振幅明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组ERG潜伏期和幅值变化

2.3各组视网膜组织中MDA、CAT和SOD含量检测 各组注射3 w后，与正常对照组相比，模型组MDA含量明显升高、CAT和SOD含量明显降低(P<0.05)；模型组比较，NG组和NGF+抗VEGF组MDA、CAT、SOD含量差异有统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组视网膜中MDA、CAT和SOD含量测定

2.4各组VEGF蛋白表达 由免疫组化结果所见，VEGF主要表达于内丛状层、内核层、外丛状层及神经节细胞层。与正常对照组相比，VEGF在模型组、NGF组和 NGF+抗VEGF组的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，VEGF在NGF组和NGF+抗VEGF组的蛋白表达水平明显减少(P<0.05)；与NGF组相比，VEGF在NGF+抗VEGF组的表达水平明显减少(P<0.05)。见图1。

图1 各组眼球视网膜中VEGF蛋白检测(免疫组化，×400)

3 讨 论

随着DR发病率程逐年上升的趋势，DR的防治已成为糖尿病并发症研究领域中迫在眉睫的重要课题。建立可复制性、合理性和可靠性的动物模型是深入研究DR发病机制、评判药物治疗效果及制定防治、防御措施的重要环节之一。DR实验动物模型建立是否可行、可靠和稳定及其与人类DR的类似度，直接关系到实验研究结果。经典的糖尿病动物模型主要包括以下4类，分别为化学物质(如STZ和四氧啼唆)诱导动物模型、自发性遗传性动物模型、胰腺部分切除动物模型和转基因动物模型〔6〕。STZ诱导糖尿病大鼠模型一直备受科研人员的推崇，其具有对大鼠周围组织毒性小，模型死亡率低、稳定性高，模型建立简便易行、操作程序简化等特点。STZ是一种专门选择性破坏动物胰岛β细胞的药物，其作用是通过诱导产生一氧化氮(NO)实现的。在体内，NO具有参与自由基级联反应、抑制线粒体功能、β细胞代谢和胰岛素分泌等作用，结果可使FBG升高〔7〕。然而，STZ对视网膜则没有毒性作用。目前认为，利用STZ注射建立糖尿病动物模型的使用剂量没有统一标准〔8〕。研究发现〔9〕，小剂量多次注射STZ可成功建立糖尿病动物模型，该方法与糖尿病发生发展的自然病程相近，能使胰岛功能发生渐进性损伤，且可有效降低模型动物的死亡率。此外，有研究认为，雌性鼠建立糖尿病动物模型的成功率较雄性鼠更低，其原因与雌激素对血管具有保护作用有关〔10〕。基于此，本课题选用雄性大鼠作为研究对象。

针对视网膜电生理的研究，刘文舟等〔11〕的研究结果显示，DR患者ERG的a、b波振幅(尤其是b波的振幅)改变敏感。在DR早期，当眼底未发生病理改变时，就可检测到ERG异常。ERG可敏感并客观反映出视网膜内层血液循环的状态。尤其是在DR患者住院的前期已经出现Ops总波振幅降低并伴有子波振幅选择性降低的现象〔12〕。所以，Ops波在DR患者早期诊断和治疗效果评价有着不可替代的重要价值〔13〕。目前认为，DR早期病变中即可出现Ops总波幅变化，提示其是DR早期诊断敏感的指标之一〔14〕。此外，Ops还可反映视网膜损害的情况，沈泓等〔15〕研究表明，Ops 总波振幅与DR病情成反比，与许建华等〔16〕发表的结论一致。DR的出现再一次证明糖尿病患者的病程已经发展到不可逆的阶段，眼部周围的微环境已经受到了破坏。随着患者病程期的延续和患者血液里FBG值持续的升高，DR出现的概率会更大〔17〕。

本实验结果表明，VEGF蛋白表达对糖尿病眼病的发生和发展过程起到了重要作用，因糖尿病眼病患者的玻璃体VEGF浓度高，可能与玻璃体为矫治物体相关，可利于VEGF 的浓缩及储存〔18〕。在视网膜中分泌VEGF后，渗入玻璃体中储存。而房水中VEGF是在睫状突形成后，经后房循环，从小梁网进入房水静脉内，经房水中循环，从而形成 VEGF 水平上升〔19〕。已经有学者研究显示〔20〕，玻璃体VEGF水平上升，是导致糖尿病患者出现玻璃体DR的独立危险因素。VEGF为最新检查出的新生血管生长因子，其具有较强的促分裂能力〔21〕。眼睛未出现病变时，视网膜周边细胞、内皮细胞、视网膜色素上皮细胞均会形成较低的 VEGF，已经有学者研究表示〔22〕，VEGF在糖尿病眼病发展中具有重要作用。相较于未出现视网膜病变患者，视网膜病变组的 VEGF 水平明显较高，且与血清胰岛素样生长因子(IGF)-1、胰岛素抵抗呈密切相关性，在不同眼部疾病房水中，VEGF浓度同样存在差异。研究结果显示〔23〕，糖尿病视网膜病变患者，慢性闭角型青光眼患者及新生血管性青光眼患者VEGF水平均有明显差异(P<0.05)。在正常情况下，组织中VEGF表达水平较低，而当组织血供丰富且代谢旺盛时，VEGF 水平将相应升高，同样，在病理条件下，其表达也会升高。

综上，在2型糖尿病患者DR中，VEGF 水平明显上升，IGF-1 水平随之上升，呈相互影响关系〔24〕。随着我国科研工作者和世界上科研人员对糖尿病眼病的发病机制不断深入的研究，对糖尿病眼病患者的治疗技术和方法也会可获得突飞猛进的发展。