HPLC测定灯芯炭煅制过程中二种菲类化合物的含量变化*

李 军,孙云峰,刘 丽,袁 媛,范 颖,郑大勇

(1 辽宁中医药大学中医学院，辽宁 沈阳 110032；2 华北理工大学药学院，河北 唐山 063210)

灯心草药材为灯心草科植物灯心草(JuncuseffususL.)的干燥茎髓，其体轻，质软，略有弹性，易拉断，断面白色。该药气微，味淡，微寒，归心、肺、小肠经，能清心火，利小便，用于心烦失眠，口舌生疮，尿少涩痛[1]。2020 年版《中国药典》收录，灯心炭为灯心草的煅炭品，能凉血止血、清热敛疮，可外用治疗口疮、咽痹、乳蛾、阴疳等[1]。灯心炭常用的煅制方法有以下几种，瓦罐煅法、扣锅煅法、扣锅双面煅法、煅锅煅法、铁桶煅法、火烧煅法、青竹煅法[2]。此外，灯芯草所含主要化学成分为菲类和二氢菲类化合物，根据文献报道该类成分具有多种生物活性，如抗菌、镇静、抗肿瘤、抗氧化等[3-7]。

灯心草的瓦罐煅法记载于清代刘若金的《本草述》一书中“灯心最难成炭，一烧即过，要能得炭，必紧扎作一把，令坚实塞入罐内，固济煅之，罐红为度，待冷取出，方有存性黑炭”[8]。本研究参考上述传统瓦罐煅法炮制灯心炭，并利用现代加热控温仪器和成分分析仪来研究灯芯草煅炭工艺[9-11]。我们利用HPLC技术建立了同时测定灯心草中厄弗酚和去氢厄弗酚2种成分的分析方法，来检测在煅炭过程中它们的含量变化，从而为灯心炭的炮制工艺提供科学依据。

1 实 验

1.1 仪器、试剂与试药

GW-300C箱式电阻炉，河北慧采科技有限公司；岛津LC-20AT，LC solution色谱工作站，SPD-20A紫外检测器，日本岛津；TD-25型电子分析天平，丹佛仪器有限公司； SIMS50000 超纯净水器，美国MILLIPORE；旋转蒸发仪，上海亚荣；KQ-100b型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；鼓风恒温干燥箱，上海精宏。

灯芯草药材购买于北京同仁堂沈阳大药房有限公司(批号：20200517，产地：江西上饶)，由辽宁中医药大学中医学院孙云峰实验师鉴定为灯心草植物灯心草JuncuseffususL.的干燥的茎髓；厄弗酚和去氢厄弗酚对照品购买于国家标准物质资源平台(批号：191211和191225，HPLC 纯度为99.0%，符合定量要求)；高效液相色谱用水为超纯水机制备，甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

1. 2 方 法

1.2.1 药材的准备

取灯芯草药材置于恒温干燥箱内，80 ℃烘干至恒重，放凉，备用。

1.2.2 制备灯芯炭

精密量取2.0 g灯芯草，放入瓦罐中，加盖后用石膏密封，再将瓦罐放入电阻炉内，设定温度为300 ℃，炉内逐渐升温至设定温度后，开始计时，分别在5，10，15，30，60，90 min时从电阻炉内取出瓦罐，自然冷却至室温，再将瓦罐内的药材取出，称重。

1.2.3 HPLC检测条件

(1)色谱条件。色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流速：1.0 mL/min；检测波长：289 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸/水溶液(B)，梯度洗脱：0～8 min，40%→40%A；8～18 min，40%→55% A；18～50 min，55%→55% A。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

(2)混合对照品溶液的制备。分别精密称取对照品厄弗酚(0.0205 g)和去氢厄弗酚(0.0317 g)，加甲醇溶解，并定容于50 mL容量瓶中，摇匀，即为对照品储备液；再精密吸取上述储备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度线，摇匀，即配成含量分别为厄弗酚41.0 μg/mL和去氢厄弗酚63.4 μg/mL的混合对照品溶液，冷藏(4 ℃)，备用。

(3)供试品溶液的制备。取灯芯草2.0 g，精密称定，置于具塞三角烧瓶中，精密加入200 mL甲醇，称定总重量并记录后，超声处理30 min (功率为250 W，频率为40 kHz)，取出，放至室温，称重，用甲醇补充减失的重量，充分摇匀，吸取100 mL溶液至茄形瓶内，然后在50 ℃水浴中用旋转蒸发仪蒸干溶剂，再用甲醇将残渣复溶并转移至10 mL容量瓶内，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液2 mL，即得供试品溶液，备用。

(4)线性关系考察。分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL进样，按照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，得出厄弗酚的回归方程：Y=406610X-97372 (r=0.9997)，其进样量在0.0410～1.025 μg范围内线性关系良好；去氢厄弗酚的回归方程：Y=636224X+30805 (r=0.9992)，其进样量在0.0634～1.5850 μg范围内线性关系良好。

(5)精密度试验。精密吸取“2.4”项下的混合对照品溶液20 μL，按照“2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定厄弗酚和去氢厄弗酚的峰面积值，计算两者RSD值分别为0.91%和1.54%，表明仪器的精密度良好。

(6)稳定性试验。精密取灯芯草药材的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h测定厄弗酚和去氢厄弗酚的峰面积，结果RSD分别为1.67%和1.32%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

(7)重复性试验。精密称取灯芯草药材2.0 g，共6 份，分别按“2.5”项下方法平行操作，制备供试品溶液，以“2.3”项下色谱条件进样测定。结果厄弗酚和去氢厄弗酚的RSD 分别为0.96%、1.33%，表明本方法重复性良好。

(8)加样回收率试验。精密称取灯芯草药材2.0 g，共6 份，置于具塞三角烧瓶中，再分别精密加入厄弗酚和去氢厄弗酚对照品适量(与2.0 g灯芯草中各成分含量相当)，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，计算回收率。分别测得厄弗酚和去氢厄弗酚的平均回收率(n=6)为100.30%和101.27%，RSD值为1.69%和0.91%。见表1。

(9)样品测定。精密称取灯芯草及其在各时间点煅制程度不同的灯芯炭，分别约2.0 g，按照“2.5”项下方法制备供试品溶液，以“2.3” 项下色谱条件进样测定，按“2.6”项下回归方程计算厄弗酚和去氢厄弗酚的含量，结果见表2、图2。

表2 灯芯草药材和其在300 ℃煅炭过程中不同时间点测得厄弗酚和去氢厄弗酚含量的测定结果(n=3)

图2 在300 ℃下不同煅制时间灯芯草中2种成分变化趋势图

2 结果与讨论

2.1 对照品的选择

厄弗酚和去氢厄弗酚在灯芯草药材中的含量较高，并且它们在甲醇溶剂中的溶解度也很高；在预实验中，两者在色谱图内可以得到较好的分离度，所以很适合作为灯芯草药材的指标性成分。

2.2 流动相的选择

实验中考察多种流动相系统，包括甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸/水、甲醇-0.1%醋酸/水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸/水的梯度洗脱系统，测试结果显示甲醇-0.1%甲酸/水梯度洗脱可使2种菲类成分均能与杂质达到较好的分离效果。

3 结 论

中药的化学成分较为复杂，性质也不同，在高温炮制过程中多数成分都会受热分解或转化，所含水分及挥发性成分也逐渐挥散失去。本研究采用HPLC同时测定灯芯草和在其煅炭过程中二种菲类成分的含量，发现灯芯草在300 ℃煅炭过程中这两种成分的含量都发生降低，厄弗酚和去氢厄弗酚的含量分别在30 min和60 min时就低于检出限，而且，通过颜色判断灯芯草在60 min后便已基本炭化完全。因此，结合灯芯草中菲类成分的生物活性、药效差异及其临床应用等因素，需要后续更深入地研究为灯芯炭的炮制工艺提供可靠的实验基础。