不同载体固定化醋酸菌发酵甘蔗醋的对比分析

黄志，方晓纯，林波，郑凤锦，3*，陈赶林，3*

（1.广西农业科学院，广西 南宁 530007；2.广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007；3.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西 南宁 530007）

甘蔗是分布在热带和亚热带的禾本科甘蔗属植物，原产于中国及印度。广西位于我国的西南地区，具有甘蔗生长的优势条件，广西的原料蔗产量和产糖量连续29年全国排名第一，超过全国总量的60%[1]。甘蔗富含极易被人体吸收利用的蔗糖、果糖、葡萄糖等糖分，且含人体必需的微量元素，如铁、钙、磷、锰、锌等，其中铁的含量为9 mg/kg，居水果之首[2-3]；此外，甘蔗还含有谷氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸等多种氨基酸及柠檬酸、苹果酸等有机酸[4]。

甘蔗醋是以新鲜糖料甘蔗为原料，经压榨、灭菌、酒精发酵、醋酸发酵、陈酿等工艺加工而成的一类果醋饮料[5-6]。甘蔗汁经过生物发酵加工制备成果醋饮料，不仅扩大了甘蔗产业领域，增加了果醋饮料的品种，更重要的是果醋饮料是一种营养丰富、附加值高的风味饮品，赋予了甘蔗汁更高的营养价值，符合现代人们的大健康理念[7]。

固定化细胞技术是采用物理或化学手段将具有一定生理功能的生物细胞（动、植物细胞或微生物细胞等）控制在一定的空间区域[8]，利用微生物的生物转化作用来提高生产速度、稳定性和效率，使底物原料变成所需产品。固定化细胞技术的关键是固定化载体，其与产品的产量、质量有直接关系。直径只有0.4 μm～2.0 μm的醋酸菌属于细菌，比酵母更微小，因此对载体要求更严格。无机物、天然高分子、有机合成高分子是固定化醋酸菌常用的载体材料，海藻酸钠、玉米芯和稻壳均为天然高分子材料，玉米芯表面疏松、组织结构均匀、硬度适宜、韧性和耐磨性好，不易破碎，适合醋酸菌活细胞着床生长繁殖；海藻酸盐凝胶价格低廉，制备简单快速，不易被微生物降解，对生物的毒性较小，反应条件温和，应用较为广泛[9]。稻壳为价格低廉的农产品废弃物，来源丰富，我国的产量居世界首位。其结构中含有14%～16%的硅是以网络状分布的，纤维素和木质素填充在其中，这一特殊结构非常有利于制备成吸附剂[10-12]，因此稻壳可被用作固定化细胞载体。利用固定化微生物制备果醋国内外学者早有研究，韦璐等[13]将玉米芯固定化发酵生产香蕉醋，缩短了发酵时间，实现了菌种重复利用和香蕉醋连续化生产；何炯灵[14]以玉米芯、花生壳、甘蔗渣、秸秆、米糠作为固定化载体，与海藻酸钠包埋醋酸菌的固定化方法进行对比，研究得出玉米芯作为醋酸菌固定化载体进行猕猴桃醋发酵，产酸量较高且稳定性好，感官品质佳；Dias等[15]将醋酸菌和葡萄糖酸杆菌固定化后发酵树葡萄，研究表明在此方法下进行醋酸发酵酒精转化率达74.4%，且柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等有机酸产量较髙。

目前，国内果醋酿造方法主要有固态发酵法[16]、液态发酵法[17]以及固定化细胞发酵法[18]等，郑凤锦等[5]和郑平等[19]利用液态深层发酵法酿造甘蔗醋，但关于甘蔗醋固定化细胞发酵的方法少有报道。本研究选用海藻酸钠、玉米芯和稻壳3种载体固定化醋酸菌，均为改善甘蔗醋产品风味的同时保证其发酵速率，试验重复3个批次加料，对比3种固定化载体发酵甘蔗醋的总酸含量及产酸速率等，以期为甘蔗醋的工业化生产提供可靠的技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

低度甘蔗酒：由广西农业科学院农产品加工研究所按照DB45/T 1946—2019《低度甘蔗酒生产技术规程》进行制备，酒精度为12%vol；玉米芯：广西农业科学院玉米研究所；稻壳：广西农业科学院水稻研究所；LB醋酸菌：陕西鼎力生物科技有限公司；海藻酸钠（食品级）：河南糖柜食品有限公司；氯化钙（食品级）：河南万邦实业有限公司。

1.2 仪器设备

高温灭菌锅（FY-65L）：上海申安医疗器械厂；人工气候箱（BIC-300）：上海博讯实业有限公司；恒温摇床（TS-2101C）：常州国宇仪器制造有限公司；糖度计（PAL-1）：日本 ATAGO（爱拓）公司；电子天平（JA2003型）：上海良平仪器仪表有限公司；酸度计（pHS-3C）：上海雷磁仪器厂；测色仪（CM-3600A）：柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；酒精计（MC 0-40度）：河北省武强县同辉仪表厂。

1.3 方法

1.3.1 微生物细胞的固定

1.3.1.1 前处理

（1）海藻酸钠：称取4.0 g海藻酸钠溶于100 g无菌水（水温35℃）中，加入5.0 g LB醋酸菌搅拌混合均匀，滴入4%氯化钙水溶液500 mL，制得海藻酸钙包埋的固定化醋酸菌凝胶粒子，于4℃冰箱里平衡24 h后备用[20]。

（2）玉米芯：取无霉变的干燥玉米芯中间部分为试验对象，称取100 g用清水浸泡24 h，进行脱色、去味处理，反复换水蒸煮，待煮出的水变无色后，121℃高温灭菌20 min，冷却待用。

（3）稻壳：称取100 g无霉变的干稻壳颗粒，清水浸泡12 h后，进行脱色处理，反复换水蒸煮，待煮出的水变无色后，121℃高温灭菌20 min，冷却待用。

1.3.1.2 固定化处理

将备用的海藻酸钙凝胶粒子过滤，固体转入无菌容器中，并添加100 mL低度甘蔗酒，用透气封口膜封口，置于32℃恒温摇床发酵培养40 h。

将待用的玉米芯、稻壳分别转入无菌三角瓶中，并添加5.0 g醋酸菌和100 mL甘蔗酒，用透气封口膜封口，放在32℃恒温摇床发酵培养40 h。

1.3.2 工艺流程

1.3.3 固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵甘蔗醋对比试验

取5.0 g LB醋酸菌置于无菌容器中作为游离醋酸菌来对比参照，同时向海藻酸钠、玉米芯和稻壳固定化醋酸菌载体的容器中分别加入同批次初始酒精度为6%vol的低度甘蔗酒1 000 mL，于30℃的条件下静态发酵22 d，每组载体平行试验3组，定时取样检测发酵醪液中总酸含量变化，考察不同载体固定化醋酸菌发酵与游离醋酸菌对甘蔗酒醋酸发酵的影响，并对发酵完全的样品进行感官品质评价。

1.3.4 不同载体固定化醋酸菌发酵甘蔗醋对发酵效率的影响

（1）第1次发酵：将不同载体固定化醋酸菌发酵与游离醋酸菌发酵的甘蔗醋醪液于30℃的条件下静态发酵22 d，为第1次发酵。定时取样测定发酵液的总酸，考察不同载体对甘蔗酒醋酸发酵的影响。

（2）第2次发酵：待第1次发酵后将发酵液全部倒出（出料），保留固定化载体，重新补料加入1 000 mL同批次的低度甘蔗酒，于30℃的条件下静态发酵7 d，即为第2次发酵。定时取样考察不同载体对甘蔗酒醋酸发酵的影响。

（3）第3次发酵：待第2次发酵后将发酵液全部倒出（出料），继续保留固定化载体，再次补料加入1000mL同批次的低度甘蔗酒，于30℃的条件下静态发酵7 d，即为第3次发酵。定时取样考察不同载体对甘蔗酒醋酸发酵的影响，并比较各固定化材料的组织完好程度。

1.3.5 分析测定方法

酒精：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；含糖量：采用手持糖度计测定；总酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；pH值：采用pH计直接测定；色差：过滤后取上清液用台式分光测色仪测定；感官评分：按照DBS45/065—2020《食品安全地方标准甘蔗醋饮料》的感官要求进行品评，满分100分，其中色泽30分，香气30分，滋味40分。稻壳、玉米芯和海藻酸钠完好程度的判定方法：将固定化载体发酵后与发酵前对比，外观、质地完好为完好；外观、质地部分溶解为部分溶解；外观、质地完全溶解为完全溶解。

发酵产酸速率[g/（L·h）]计算公式如下[21]。

1.4 数据处理

试验结果表示为平均值±标准差；数据处理及作图采用Excel 2019；试验数据分析采用SPSS 23.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同载体固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵甘蔗醋的比较

2.1.1 不同载体固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵对总酸的影响

固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵甘蔗醋总酸含量对比见图1。

图1 固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵甘蔗醋总酸含量对比Fig.1 Comparison of total acid content of sugarcane vinegar fermented by immobilized acetobacteria and free acetobacteria

由图1可知，在醋酸发酵过程中，固定化载体的吸附性和结构不同，其发酵产酸也是有差异的。采用不同载体的固定化醋酸菌，其发酵醪液的总酸含量都明显高于游离醋酸菌发酵醪液的总酸含量，发酵22 d，不同方法和载体进行醋酸发酵的醪液中总酸含量依次为稻壳（51.2 g/L）＞海藻酸钠（32.0 g/L）＞玉米芯（25.1 g/L）＞游离醋酸菌发酵（19.1 g/L），这可能与固定化发酵系统内的细胞浓度有关，由于固定化载体的作用表面积大，分散系数高，吸附性强，醋酸菌被吸附固定后容易着床生长繁殖，导致固定化发酵系统内细胞浓度明显高于游离发酵系统，从而加快了产酸速率，快速将乙醇转化成醋酸[22]。

2.1.2 不同载体固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵对甘蔗醋品质的影响

不同载体固定化醋酸菌与游离醋酸菌发酵对甘蔗醋品质的影响见表1～表2。

表1 不同固定化载体对发酵甘蔗醋的色差影响Table 1 Effects of different immobilized carriers on color difference of fermented sugarcane vinegar

表2 不同固定化载体对发酵甘蔗醋品质的影响Table 2 Effects of different immobilized carriers on the quality of fermented sugarcane vinegar

对不同载体固定化醋酸菌的发酵醋液进行感官评价，与游离醋酸菌发酵醪液对比，从色泽上来看ΔL*值较大表示透明度较高；Δa*值为正时颜色偏向于红色色泽方向；Δb*值为正，偏向于黄色色泽方向。由表1、表2可知，以海藻酸钠、玉米芯和稻壳为载体的固定化醋酸菌发酵的醋液ΔL*值差异不大，透明度相近，且三者均比游离醋酸菌发酵的醋液颜色深，游离醋酸菌发酵的醋液ΔL*值较高而Δb*值相对较低，醋液为浅黄色，通过肉眼观察，以玉米芯和稻壳为载体的固定化醋酸菌发酵的醋液为浅棕色，和色差仪检测的结果接近。由表2可知，从香气上看，因稻壳和玉米芯本身自带果香和少量的糖分，作为固定化载体发酵的醋液，增加了其香气物质并协调厚重了醋液的酸味[14]，以玉米芯和稻壳为载体的固定化醋酸菌发酵的醋液香气和滋味都优于游离醋酸菌。从品质与感官评分得到，以稻壳为载体发酵的醋液香气最浓，醋体透亮，其感官评分最高，为91，其次是玉米芯，为90，以海藻酸钠为载体发酵的醋液有轻微浑浊。

2.2 不同载体固定化醋酸菌发酵甘蔗醋对发酵效率的影响

2.2.1 第1次发酵

不同载体固定化醋酸菌第1次发酵甘蔗醋的总酸含量变化结果见图2，不同载体固定化醋酸菌第1次发酵甘蔗醋的产酸速率对比结果见图3。

图2 不同载体固定化醋酸菌第1次发酵甘蔗醋的总酸含量变化Fig.2 Changes of total acid content of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the first feeding

图3 不同载体固定化醋酸菌第1次发酵甘蔗醋的产酸速率对比Fig.3 Comparison of acid production rates of sugarcane vinegar with different immobilized carriers in the first fermentation

由图2可知，以稻壳为载体的发酵液发酵作用最为显著，发酵1 d时其总酸含量最高，这与稻壳的作用表面积大且分散系数高有直接关系，其次是玉米芯；以稻壳或玉米芯为固定化载体的发酵液总酸含量随着时间的延长不断上升，发酵至7 d时以稻壳为固定化载体的发酵液总酸含量最高达到24.1 g/L，以玉米芯为固定化载体的发酵液总酸含量只达到15.9 g/L；海藻酸钠的发酵液总酸含量先缓慢下降，可能是醋酸菌细胞继续大量繁殖，产酸较慢，加入酒液后稀释了活化后的总酸，在发酵1 d后其总酸含量开始升高，1 d～4 d时总酸含量升高比较缓慢，表现为曲线比较平稳，4 d后总酸含量增加较快；发酵7 d，总酸含量从高到低的顺序：稻壳（24.1 g/L）＞玉米芯（15.9 g/L）＞海藻酸钠（13.2 g/L）。

由图3可知，3种载体固定化醋酸菌发酵甘蔗醋的产酸速率随着时间的延长呈正增长的趋势，产酸速率从高到低的顺序为稻壳＞玉米芯＞海藻酸钠，这可能与固定化载体的表面积有关，可接触的表面积大吸附性强，更利于醋酸菌固定在上面生长繁殖，将乙醇转化成醋酸[23]。发酵至7 d时以稻壳为固定化载体的发酵液产酸速率最高，达到1.0 g/（L·h），以玉米芯为固定化载体的发酵液达到0.66 g/（L·h），以海藻酸钠为固定化载体的发酵液达到0.55 g/（L·h）。

2.2.2 第2次发酵

不同载体固定化醋酸菌第2次发酵甘蔗醋的总酸含量变化结果见图4，不同载体固定化醋酸菌第2次发酵甘蔗醋的产酸速率对比结果见图5。

图4 不同载体固定化醋酸菌第2次发酵甘蔗醋的总酸含量变化Fig.4 Changes of total acid content of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the second feeding

图5 不同载体固定化醋酸菌第2次发酵甘蔗醋的产酸速率对比Fig.5 Comparison of acid production rates of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the second feeding

由图4可知，第2次发酵后，以稻壳为固定化载体的发酵液随着时间增加总酸含量上升最快，其次是玉米芯，发酵2 d后这两个发酵液产酸含量呈上升的趋势，发酵至7 d，以稻壳为固定化载体的发酵液总酸含量高达28.1 g/L，以玉米芯为固定化载体的发酵液总酸含量为18.7 g/L；而以海藻酸钠为固定化载体的发酵液在发酵前4 d其总酸含量变化不明显，发酵4 d后其总酸含量增加较为明显，曲线呈缓慢上升趋势，但都低于以稻壳或玉米芯为固定化载体的发酵液总酸含量。发酵7 d，用不同载体材料进行固定化醋酸发酵的最高总酸含量依次为稻壳（28.1 g/L）＞玉米芯（18.7 g/L）＞海藻酸钠（13.7 g/L），这与何炯灵[14]利用固定化醋酸菌发酵猕猴桃醋的二批次发酵的现象较为一致。

由图5可知，3种载体固定化醋酸菌第2次发酵的发酵液产酸速率在同一发酵时间均高于第1次加料的产酸速率；3种载体的发酵液产酸速率随着时间的增加不断上升，其中以稻壳为固定化载体的发酵体系产酸速率增加最为明显，当发酵至7 d时，其产酸速率最高，为1.17 g/（L·h），以玉米芯为固定化载体的发酵体系产酸速率在7 d时达到最高，为0.78 g/（L·h），以海藻酸钠为固定化载体的发酵液的产酸速率在发酵4 d前增加不明显，产酸速率都在0.40 g/（L·h）左右，随着时间的增加，在发酵7 d时其产酸速率最高为0.57 g/（L·h）。

2.2.3 第3次发酵

不同载体固定化醋酸菌第3次发酵甘蔗醋的总酸含量对比结果见图6，不同载体固定化醋酸菌第3次发酵甘蔗醋的产酸速率对比结果见图7。

图6 不同载体固定化醋酸菌第3次发酵甘蔗醋的总酸含量对比Fig.6 Changes of total acid content of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the third feeding

图7 不同载体固定化醋酸菌第3次发酵甘蔗醋的产酸速率对比Fig.7 Comparison of acid production rates of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the third feeding

由图6可知，第3次发酵1 d时，以稻壳为固定化载体的发酵体系中总酸含量最高，但发酵2 d时，以玉米芯为固定化载体的发酵体系总酸含量上升至最高值，之后随着时间的增加其总酸含量升高趋于缓慢，发酵7 d其总酸含量最高达41.5 g/L；第2次补料后，以稻壳作为载体的发酵体系总酸含量随着时间的增加仍然不断上升，发酵5 d其总酸含量最高为40.7 g/L，随后其总酸含量略有下降，这主要是因为醋酸菌在缺乏营养物质的情况下会分解部分醋酸获得能量而导致的[14]；以海藻酸钠为固定化载体的发酵体系在发酵2 d后其总酸含量变化不明显，趋于平缓，其总酸含量保持在20.5 g/L左右，这可能与海藻酸钠是采用包埋法固定制作而成有关，固定化处理过程中为了多包埋醋酸菌细胞及增强凝胶珠与发酵液之间的物质交换能力，会限制海藻酸钠与钙离子浓度，从而导致凝胶珠强度比较低，易溶出，影响其重复使用性与寿命[9]。因此菌种繁殖速度降低，产酸速度变慢。

由图7可知，稻壳和海藻酸钠的发酵体系产酸速率在发酵1d时最高，分别为1.01、0.64 g/（L·h），之后随着时间的增加产酸速率不断下降，醋酸发酵后期高酸度的发酵醪液对醋酸菌具有抑制作用[23]，包埋细胞逐渐凋亡等原因也导致产酸量下降；以玉米芯为固定化载体的发酵体系产酸速率在发酵2 d时达到最高值，为0.82 g/（L·h），随后逐渐下降。在每个发酵时间内，海藻酸钠发酵体系的产酸速率都低于以玉米芯或稻壳为固定化载体的发酵体系产酸速率；同时玉米芯发酵体系的产酸速率在1 d时低于以稻壳发酵体系，但发酵1 d后，其产酸速率均高于以稻壳为固定化载体的发酵体系的产酸速率，这充分表明3次补料后，玉米芯作为载体的发酵体系中醋酸菌总数相对较高，将乙醇转化成醋酸作用时间更长。

2.3 3次发酵后固定化菌种的完好程度比较

3次发酵后，不同载体固定化醋酸菌发酵后的发酵体系完好程度及菌膜生长情况见表3。

表3 固定化醋酸菌种的完好程度变化和菌膜生长情况Table 3 Changes of immobilized acetic acid strain integrity and bacterial film growth

由表3可知，第1次发酵结束后，3种载体固定化菌种都完好；但第2次发酵后，以海藻酸钠为载体的固定化凝胶颗粒开始出现溶解的现象，第3次结束后，其溶解更多，稳定性较差；而以玉米芯或稻壳为载体经过3个批次发酵后组织形态还保留完好。综合比较，以海藻酸钠为载体的固定化凝胶颗粒重复发酵使用的周期远远不及以玉米芯或稻壳为固定化载体的周期长，后者可连续发酵利用3次以上。以海藻酸钠或以稻壳为固定化载体的发酵液在第2次发酵时表面开始产生一层白色菌膜，至第3次发酵时游离醋酸菌和固定化醋酸菌的发酵液表面都长有白色菌膜。魏冉等[24]曾提出在静态发酵中菌膜的形成是发酵液正常发酵的表现，在自然发酵的食醋中，一层薄菌膜的产生是造醋成功的标志，产生的菌膜可控制O2通透性，避免杂菌污染。何炯灵[14]研究表明菌膜粘附在载体表面，会导致载体通氧量不足及液体无法顺利下流，故产酸稳定性变差。综合对比图2、图4、图6，发现第3次发酵，以玉米芯为载体的固定化发酵体系中，后期的总酸含量高于稻壳，这可能与菌膜的附着有关，影响了稻壳作为载体的固定化发酵的产酸稳定性。

3 结论

从产酸量的角度考虑，分别以海藻酸钠、玉米芯和稻壳为固定化载体连续发酵甘蔗醋，3种不同载体的发酵能力明显高于游离醋酸菌发酵；其中稻壳、玉米芯体系以吸附法固定醋酸菌产酸的作用最明显，且玉米芯和稻壳自身的结构组织状态比较好，没有出现变软变烂的现象；海藻酸钠体系以包埋法固定醋酸菌产酸，因为兼顾醋酸菌细胞及凝胶珠与发酵液之间的物质交换能力，海藻酸钠与钙离子浓度不能太高，因此凝胶珠不够牢固，易溶出从而减短寿命，导致产酸能力低于稻壳、玉米芯体系。从稳定性和使用寿命的角度考虑，经过3批次连续发酵后，玉米芯体系相对于稻壳体系的产酸性能更稳定些；玉米芯自身组织均匀、硬度适宜、韧性好、耐磨性好，在使用过程中不易破碎，且具有很大的表面积，表面疏松，通透性强，很适合醋酸菌活细胞着床生长发酵繁殖。在固定化处理方面，玉米芯相对于稻壳更便于处理，从而降低成本。海藻酸钠在第2次发酵后就出现溶解的现象，稳定性稍差，不适宜做甘蔗醋的固定化载体。综合生产成本、生产工艺的可便性、稳定性等方面考虑，玉米芯更适合作为固定化载体来发酵甘蔗醋。