3种芩柏制剂体外经皮渗透特性及其抗银屑病作用

曾祖平， 张 璐， 王天园， 付 京， 韩旭阳， 王 宏

(首都医科大学附属北京中医医院，北京市中医药研究所，银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室，北京 100010)

芩柏软膏收载于《北京市医疗机构制剂规程》[1]，来源于皮肤外科名老中医赵炳南先生的临床经验方，全方由黄芩、关黄柏组成，具有清热解毒、利湿消肿之功效，主治热毒疮疖、蜂窝织炎等[2], 临床上用于治疗银屑病、毛囊炎、皮炎、湿疹等[3-4]。为了减少皮肤刺激性，提高依从性和疗效，课题组前期通过提取工艺、制剂成型工艺研究结合成熟的乳膏配方[5]，将芩柏软膏制成凝胶、乳膏剂型[6-7]，并评价三者体外释药[8]。在此基础上，本实验进一步考察芩柏软膏、芩柏凝胶、芩柏乳膏中黄芩苷、盐酸小檗碱体外经皮渗透特性，以期为筛选相关制剂的适宜剂型提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司，配置G1312A二元泵、G1313A自动进样器、G1365B多波长紫外检测器、Agilent Chemstation色谱工作站)；RYJ-B型药物透皮扩散实验仪(上海黄海药物仪器有限公司)；SK7210HP型KUDOS超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；超声波细胞破碎仪(德国Bandelin公司)；全自动染色机、轮转切片机(德国Leica公司)；XS205型电子天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试剂与药物 芩柏凝胶(自制，批号20170828，黄芩苷含量1.20%，盐酸小檗碱含量0.15%)；芩柏乳膏(自制，批号20170726，黄芩苷含量1.28%，盐酸小檗碱含量0.13%)；芩柏软膏(自制，批号20170315，黄芩苷含量1.22%，盐酸小檗碱含量0.16%)；咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司，批号16110239)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司，批号01810754)。乙腈、磷酸为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水(自制)。

1.3 动物 BALB/c雄性小鼠，体质量20～22 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2014-0004。实验经北京市中医研究所动物伦理委员会批准。

2 方法与结果

2.1 体外经皮渗透实验

2.1.1 正常皮肤制备 小鼠断颈处死，背部去毛(约2 cm×2 cm)后剪下皮肤，去除皮下脂肪组织和结缔组织，生理盐水冲洗干净，拭干表面水分，即得，立即使用。

2.1.2 模型皮肤制备 参考Van der Fits等[9]报道的方法。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(80 mg/kg)麻醉，背部去毛(约2 cm×2 cm)，单笼饲养。次日取背部光滑、无伤口的小鼠，每天背部涂抹咪喹莫特乳膏50 mg，第5天断颈处死，剪下背部银屑病样皮损皮肤，去除皮下脂肪组织和结缔组织，生理盐水冲洗干净，拭干表面水分，即得，立即使用。

2.1.3 实验操作 采用改良的Franz扩散池[9]。将新鲜小鼠皮肤固定于扩散池上下两部分之间，构成扩散室和接收室，表皮面向扩散室，扩散室底面积2.009 6 cm2，接收室容积6.6 mL。精密称取芩柏软膏、芩柏凝胶、芩柏乳膏各3份，每份0.5 g，涂满整个表皮，在接收室中注入生理盐水作为接收液，排出气泡，使液面完全与真皮接触，在恒速(150 r/min)、恒温(37 ℃)下于1、2、4、6、8、10、12 h吸取接收液各3 mL，滤过，补加等体积的生理盐水，测定滤液中黄芩苷、盐酸小檗碱含量，计算累积渗透量Q，拟合体外经皮渗透方程[8]，结果见表1～2，再以Q对时间t作图，得体外经皮渗透曲线，见图1～2。

表1 3种芩柏制剂经小鼠正常皮肤的渗透参数(n=3)Tab.1 Permeation parameters for three Qinbai preparations through normal mouse skins(n=3)

图1 3种芩柏制剂12 h内经小鼠正常皮肤渗透曲线Fig.1 Permeation curves for three Qinbai preparations through normal mouse skins within 12 h

注：盐酸小檗碱仅在芩柏凝胶8、10、12 h渗透液及芩柏软膏10、12 h渗透液中检出，而在芩柏乳膏中未检出，故仅绘制黄芩苷经皮渗透曲线。图2 3种芩柏制剂12 h内经小鼠模型皮肤渗透曲线Fig.2 Permeation curves for three Qinbai preparations through model mouse skins within 12 h

表1显示，3种芩柏制剂经小鼠正常皮肤的体外经皮渗透过程均符合零级动力学方程，黄芩苷、盐酸小檗碱渗透速率依次为芩柏凝胶>芩柏乳膏>芩柏软膏，两者12 h内累积渗透量依次为芩柏凝胶>芩柏乳膏>芩柏软膏。表2显示，3种芩柏制剂中黄芩苷经小鼠模型皮肤的体外经皮渗透过程均符合零级动力学方程，黄芩苷12 h内累积渗透量依次为芩柏凝胶>芩柏乳膏>芩柏软膏。另外，小鼠正常皮肤中黄芩苷、盐酸小檗碱渗透速率、12 h累积渗透量高于小鼠模型皮肤中。

表2 3种芩柏制剂经小鼠模型皮肤的渗透参数(n=3)Tab.2 Permeation parameters for three Qinbai preparations through model mouse skins(n=3)

图1显示，3种芩柏制剂中黄芩苷、盐酸小檗碱在不同时间点经小鼠正常皮肤的累积渗透量依次为芩柏凝胶>芩柏乳膏>芩柏软膏。图2显示，3种芩柏制剂的黄芩苷在不同时间点经小鼠模型皮肤的累积渗透量依次为芩柏凝胶>芩柏乳膏>芩柏软膏。

2.1.4 皮肤储药量测定 体外经皮渗透实验结束后，沿扩散池边缘剪下有效渗透面积的小鼠皮肤(约2.009 6 cm2)，用棉签蘸取生理盐水，将皮肤表面残留药物擦拭干净，剪碎，置于玻璃匀浆管中，加入1 mL甲醇研磨5 min至匀浆状，转移至离心管中，9 mL甲醇分次洗涤匀浆器，洗液并入离心管中，超声处理10 min后4 000 r/min离心10 min，吸取上清液至EP管中，氮吹至干，2 mL甲醇溶解，滤过，测定滤液中黄芩苷、盐酸小檗碱含量，结果见表1～2。

由此可知，小鼠正常皮肤中黄芩苷、盐酸小檗碱12 h皮肤储药量高于小鼠模型皮肤中；与芩柏软膏比较，芩柏凝胶中上述2种成分在小鼠正常皮肤中的储药量明显升高，并且黄芩苷在小鼠模型皮肤中的储药量也明显升高。另外，黄芩苷12 h皮肤储药量依次为凝胶剂>乳膏剂>软膏剂；盐酸小檗碱12 h皮肤储药量在小鼠正常皮肤中依次为凝胶剂>乳膏剂>软膏剂，在小鼠模型皮肤中依次为凝胶剂>软膏剂>乳膏剂。

2.2 3种芩柏制剂对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型皮损的影响

2.2.1 造模、分组与给药 按“2.1.2”项下方法造模。小鼠去毛后，采用随机数字表法分为空白组、模型组、丁酸氢化可的松乳膏(尤卓尔)组、芩柏凝胶组、芩柏乳膏组、芩柏软膏组，每组8只。除空白组外，其余各组小鼠背部每天下午涂抹5%咪喹莫特乳膏约50 mg，连续5 d，每天上午9点再涂抹50 mg相应药物，连续6 d。

2.2.2 银屑病皮损面积和疾病严重程度指数(PASI)评分计算 每天上午给药前，采用数码照相机拍照记录小鼠皮损情况，并依据PASI评分标准[10]计算红斑、鳞屑、浸润程度评分，无及轻、中、重、极重度分别计0、1、2、3、4 分，以三者评分总和为总评分。

图3显示，空白组小鼠皮肤光滑，无鳞屑、红斑和浸润现象；模型组小鼠于第2～3天开始出现轻微的背部皮肤鳞屑、红斑、浸润，随造模时间延长皮损不断加重，鳞屑多而厚，红斑由点状变为斑块状，皮肤变硬变厚浸润明显，提示模型建立成功；与模型组比较，3种芩柏制剂组小鼠银屑病样皮损症状有所缓解。

图3 各组小鼠皮损Fig.3 Mouse skin lesions in various groups

图4显示，与模型组比较，尤卓尔组小鼠皮损PASI评分降低(P<0.05)，而3种芩柏制剂组小鼠皮损PASI评分无明显变化(P>0.05)。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图4 各组小鼠皮损PASI评分Fig.4 PASI scores for mouse skin lesions in various groups

2.2.3 小鼠皮损组织形态学观察 第6天小鼠注射过量戊巴比妥钠后处死，剪取背部相同部位皮肤(约0.8 cm×0.8 cm)，展平，10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色后在400倍光镜下拍片，采用IPP 6.0图像分析软件，每个标本选取5张切片进行观察，每张随机测量5处从表皮角质层到基底层的垂直厚度，分析表皮层变化情况。

图5显示，空白组小鼠皮肤表皮层较薄；模型组小鼠表皮突延长，表皮棘细胞层明显增厚，基底细胞核分裂像较多，并可见明显的角化不全及角化过度，炎症细胞浸润严重；与模型组比较，3种芩柏制剂组、尤卓尔组小鼠表皮层变薄，角化不全、角化过度改善，炎症细胞浸润程度减轻。

表3显示，与模型组比较，3种芩柏制剂组、尤卓尔组小鼠表皮厚度减少(P<0.01)。

表3 各组小鼠表皮厚度Tab.3 Mouse epidermal thicknesses in various

3 讨论与结论

药物体外经皮渗透特性受药物理化性质、经皮给药系统、皮肤生理病理的影响[11]。芩柏软膏、芩柏凝胶、芩柏乳膏组方药材相同，区别在于剂型及皮肤状态，其中芩柏凝胶主要基质为水性凝胶基质，生物相容性好，延长了制剂在用药部位的停留时间，而且其黏度小，有利于药物释放与渗透；芩柏软膏基质为凡士林，属于油脂性软膏基质，疏水性大，释药性能差；芩柏乳膏基质为O/W型乳剂，理论上药物释放、透皮吸收速度更快，但本实验发现该制剂中黄芩苷、盐酸小檗碱体外经皮渗透速度和程度小于芩柏凝胶，其原因可能是药物与乳膏基质结合紧密，不利于其释放和渗透[5]。正常皮肤中黄芩苷、盐酸小檗碱12 h储药量大于模型皮肤中，这是因为银屑病样小鼠皮损表皮较正常皮肤明显增厚，角质形成细胞异常增生，而角质层为体外经皮渗透的主要屏障，从而阻碍了药物的被动扩散。另外，盐酸小檗碱属季胺盐型离子型药物，透皮性较差，在模型皮肤渗透液中几乎未检出。

注：A～F分别为空白组、模型组、芩柏乳膏组、芩柏凝胶组、芩柏软膏组、尤卓尔组。图5 各组小鼠皮损组织形态学Fig.5 Histomorphologies for mouse skin lesions in various groups

作为芩柏制剂药效成分，黄芩苷能改善咪喹莫诱导的小鼠银屑病样炎症[12]，局部应用小檗碱油酸复合物的液晶纳米储库水凝胶可明显减轻银屑病症状及银屑病炎性细胞因子水平[13]。本实验发现，3种芩柏制剂的PASI评分均不理想，推测可能与中药在皮肤上有残留而影响观察有关，但不影响小鼠皮损组织形态学观察结果。该成分透皮特性表现为芩柏凝胶渗透速率、累积渗透量、皮肤储药量高于芩柏乳膏、芩柏软膏，但三者药效无显著差异，其原因可能为一方面在本实验条件下量效关系不明显，另一方面外用制剂基质对药效有影响。

综上所述，芩柏凝胶渗透速率、累积渗透量、不同皮肤储药量高于芩柏乳膏、芩柏软膏，并且3种芩柏制剂均有抗银屑病作用，但最终剂型还需通过临床试验来确定。