防己与甘草在防己黄芪汤中配伍后3种成分的变化

翟康欣， 遆安航， 李思思， 魏 珊， 裴香萍， 张淑蓉*

(1.山西中医药大学中药学院，山西 晋中 030619；2.山西鑫煜制药有限公司，山西 晋中 030600)

《金匮要略》记载，防己黄芪汤由防己、黄芪、白术、甘草组成，配伍生姜、大枣煎服，具有益气祛风、健脾利水之功效，主治风湿或风水之表虚不固、脉浮身重、汗出恶风[1]，现代药理研究表明该方可用于治疗关节炎症、水肿、风湿免疫、肾脏疾病、肺部疾病等[2]，方中防己主要含有粉防己碱、防己诺林碱等成分，甘草主要含有甘草酸等成分，两者为酸碱对药，配伍后可能会形成酸碱复合物沉淀[3]。本实验参考裴妙荣等[4-6]研究“大黄硝石汤”“四逆汤”“大黄附子汤”的方法，考察防己、甘草单味药水煎液、防己-甘草对药水煎过滤液、防己-甘草对药水煎离心液、全方水煎过滤液、全方水煎离心液、乙醇回流提取液等不同配伍、提取方法处理后粉防己碱、防己诺林碱、甘草酸提取量的变化及酸碱复合物的形成，并考察了酸碱复合物在人工胃液、人工肠液中的解离情况，以期探求碱性药防己与酸性药甘草在防己黄芪汤中配伍的化学变化规律，从而为该方药效物质研究及临床应用提供参考。

1 材料

Waters高效液相色谱仪系统，配置Miliennum32色谱工作站(美国Waters公司)；电子天平(FA2104 型，上海第二分析仪器厂)；离心机(LD5210型，北京医用离心机厂)。防己、甘草、黄芪、白术均购自河北安国药材市场，经山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品。防己诺林碱(批号110793-200605)、粉防己碱(110711-200708)、甘草酸铵(批号110731-200614)对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 不同配伍提取液制备 按处方比例[防己-黄芪-甘草(蜜炙)-白术=4∶5∶2∶3][1]精密称取防己、甘草单味药，防己-甘草对药，防己黄芪汤全方，第1次加10倍量水浸泡30 min后煎煮45 min，第2次加8倍量水后煎煮30 min，合并煎液，一部分提取液双层纱布过滤，作为水煎过滤液；另一部分提取液3 000 r/min离心15 min，作为水煎离心液。精密称取单味药、对药及全方，95%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量，第2次加8倍量，每次1 h，合并，作为乙醇提取液。另取黄芪、甘草、白术，同法制成缺防己的阴性样品溶液；取防己、黄芪、白术，同法制成缺甘草的阴性样品溶液。

2.2 防己生物碱提取量测定

2.2.1 色谱条件 依利特Hypersil BDS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.3%甲醇-二乙胺(73∶27)；体积流量1 mL/min；柱温室温；检测波长242 nm，色谱图见图1。由此可知，防己诺林碱、粉防己碱均达到基线分离，阴性无干扰。

1.防己诺林碱 2. 粉防己碱图1 防己诺林碱、粉防己碱HPLC色谱图

2.2.2 对照品溶液制备 精密称定防己诺林碱、粉防己碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含两者0.1、0.064 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 精密吸取“2.1”项下水煎过滤液与水煎离心液(相当于1 g防己)，NaOH溶液调节pH至12，等量乙醚萃取5次，合并萃取液，低温回收，甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得；精密吸取“2.1”项下乙醇提取液(相当于1 g防己)，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.2.4 方法学考察 取“2.2.2”项下对照品溶液6份，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得到方程分别为粉防己碱Y=1 947 266.5X-7 912.8(r=0.999 7)，在0.2～2.0 μg范围内呈良好的线性关系；防己诺林碱Y=1 672 714.2X-10 025.7(r=0.999 8)，在0.128～1.28 μg范围内呈良好的线性关系。粉防己碱精密度、稳定性(12 h)、重复性试验峰面积RSD分别为2.05%、2.90%、2.70%，平均加样回收率为100.21%，RSD为2.53%；防己诺林碱三者峰面积RSD分别为2.25%、2.92%、2.29%，平均加样回收率为102.5%，RSD为1.10%，均符合相关要求。

2.2.5 结果分析 精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算提取量，结果见表1。由此可知，水煎煮提取液中防己生物碱提取量随着防己单药、防己-甘草对药、防己黄芪汤全方的配伍变化依次降低，离心后更明显；过滤后防己-甘草对药生物碱提取总量是防己单药的81.1%，全方为47.8%；离心后防己-甘草对药生物碱提取总量是防己单药的56.7%，全方为35.7%；乙醇回流提取液中防己生物碱提取量与水煎过滤液的变化趋势相反，即随着防己单药、防己-甘草对药、防己黄芪汤全方的配伍变化，提取量依次增高。

表1 粉防己碱、防己诺林碱提取量测定结果(n=3)

2.3 甘草酸提取量测定

2.3.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相0.2 mol/L甲醇醋酸铵-冰醋酸(63∶37∶1)；体积流量1 mg/mL；柱温室温；检测波长250 nm，色谱图见图2。由此可知，甘草酸与其他成分达到基线分离，阴性无干扰。

1.甘草酸图2 甘草酸HPLC色谱图

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取甘草酸单铵盐对照品适量，“2.3.1”项下流动相定容至10 mL量瓶中，制成含该成分0.265 0 mg/mL(折合甘草酸为0.259 6 mg/mL)的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 精密吸取“2.1”项下水煎过滤液、水煎离心液(相当于1 g甘草)适量，浓缩至10 mL，“2.3.1”项下流动相定容至25 mL量瓶中，滤过，即得；精密吸取“2.1”项下乙醇提取液(相当于1 g甘草)适量，蒸干，“2.3.1”项下流动相定容至25 mL量瓶中，滤过，即得。

2.3.4 方法学考察 取“2.3.2”项下对照品溶液6份，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得到方程分别为甘草酸Y=918 952.8X-11 106.4(r=0.999 6)，在0.259 6～3.894 μg范围内呈良好的线性关系。甘草酸精密度、稳定性(12 h)、重复性试验峰面积RSD分别为1.14%、2.84%、2.42%，平均加样回收率为101.6%, RSD为1.72%，均符合相关要求。

2.3.5 结果分析 精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算提取量，结果见表2。由此可知，水煎煮提取液中甘草酸提取量随着甘草单药、防己-甘草对药、防己黄芪汤全方的配伍变化依次降低，离心比过滤更明显；过滤后防己-甘草对药提取量是甘草单药的67.1%，全方为39.5%；离心后防己-甘草对药提取量是甘草单药的53.5%，全方为29.9%；乙醇回流提取液中甘草酸提取量随着甘草单药、防己-甘草对药、防己黄芪汤全方的配伍变化也依次降低，但不如水煎过滤液明显。

表2 甘草酸提取量测定结果(n=3)

2.4 水煎沉淀物在人工胃液、人工肠液中的溶解性 取“2.1”项下离心沉淀物，分别溶于15 mL人工胃液、肠液中，38 ℃水浴搅拌15 min，离心，精密吸取上清液5 mL，加入15 mL 95%乙醇，沉淀，滤过，滤液水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取上述对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.2.1”“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算提取量，结果见表3。由此可知，人工胃液、肠液中均检测到粉防己碱、防己诺林碱、甘草酸，但人工胃液中三者提取量明显低于人工肠液中，特别是防己黄芪汤全方。

表3 粉防己碱、防己诺林碱、甘草酸提取量测定结果(n=3)

3 讨论

本实验参考《中国药典》及文献[7-11]报道建立了不同配伍防己黄芪汤中防己生物碱、甘草酸含量的测定方法，并进行方法学考察，发现该方法准确快速，简便易行。再分别采用水煎煮过滤、水煎煮离心、乙醇回流提取方法比较不同配伍的防己黄芪汤，发现碱性防己与酸性甘草在合煎时形成了酸碱复合物沉淀，导致提取量减损，全方提取量进一步降低，说明方中黄芪、白术会促进沉淀生成；水煎煮离心上清液中生物碱提取量低于水煎煮过滤液中，可能是离心处理使煎液沉淀物更完全沉淀所致；以甘草/防己单药、防己-甘草对药、防己黄芪汤全方为顺序，乙醇提取液中甘草酸提取量随配伍变化依次降低，防己生物碱提取量随配伍变化依次提高，表明酸碱对药主要在水煎液中形成复合物沉淀，乙醇作为提取溶剂不宜酸碱性成分相互反应，与段秀俊等[6]报道的结果相似，这也印证了甘草酸与生物碱在酸性环境下易析出沉淀，而调至碱性环境后则不易出现的前期报道[12]。另外人工胃液、人工肠液中防己-甘草水煎沉淀物溶解性的测定结果显示，两者均发现防己生物碱、甘草酸，表明配伍后生成的复合物沉淀依然可能会在胃液及肠液的作用下重新解离出有效成分，从而发挥药效。

近年来，酸碱药对配伍产生沉淀的现象越来越受到重视，研究者已对其结构有所研究[13-16]。裴妙荣等[17]推断，四逆汤中酸碱复合物的形成是由于甘草酸糖链第2个葡萄糖醛酸的羧基与乌头碱中的氮原子缔合生成离子缔合物。本实验发现，碱性成分为防己生物碱，其结构中的氮原子类似乌头碱，均为叔胺结构，推测它与甘草酸形成复合物结构最可能类似乌头碱，即甘草酸结构中糖链第2个葡萄糖醛酸的羧基与防己生物碱的氮原子发生缔合，生成离子缔合物(图3)。但由于甘草酸分子中有3个羧基，防己生物碱有2个叔氮原子，其反应摩尔比存在多种可能，情况更复杂，有待今后进一步分离沉淀，并用核磁等手段鉴定结构。

图3 甘草酸与防己生物碱水煎煮缔合反应图