南板蓝根内生真菌分离鉴定及其生物活性研究

牟 燕， 刘世芳， 尹翠云， 唐德英， 俞 静， 张丽霞

(中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南省南药可持续利用研究重点实验室，云南 景洪 666100)

植物内生真菌是一类广泛存在于宿主植物体内的具有丰富多样生物活性的微生物类群。在长期进化过程形成了丰富的代谢系统，可产生与宿主植物相似或相同的次生代谢产物，还能独立产生大量的、结构新颖且具有多种生物活性的物质[1-2]。Satish等[3]从青翠枝植物中分离得到一株内生真菌，在其液体培养基中发现了喜树碱。石杉碱甲具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，但其获取途径单一，资源稀少，合成工艺繁琐复杂、成本高，而通过对其内生真菌的研究能获得了多个能产该成分的菌株[4-6]，具有重要应用价值和可持续发展意义。

南板蓝根为爵床科植物马蓝Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.的干燥根茎和根，含有吲哚生物碱、喹唑啉酮生物碱等多种成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒和抗炎等药理活性，并对肝脏有保护作用[7-8]，在预防和治疗严重急性呼吸道综合症中潜在功效良好[9]，但其生长周期长，产量低，野生资源分散且少，目前相关研究主要集中于资源、栽培、化学成分、生物活性等方面，鲜有涉及内生真菌。基于此，本研究采用植物组织表面灭菌法，对南板蓝根根、茎、叶中内生真菌进行分离纯化，筛选出具有生物活性的菌株，以期为该植物进一步开发利用提供参考。

1 材料

1.1 药材 南板蓝根为一年生栽培品，健康植株采自云南省红河州金平县，经中国医学科学院药用植物研究所云南分所李学兰研究员鉴定为南板蓝根Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.，标本保存于中国医学科学院药用植物研究所云南分所。

1.2 培养基

1.2.1 PDA 取洗净去皮的马铃薯200 g，切成小块状，加入1 000 mL超纯水煮沸30 min，上清液用纱布过滤，加琼脂15 g、葡萄糖20 g，搅拌溶解完全后补充超纯水至体积为1 000 mL，整个过程中pH值保持不变，在121 ℃下灭菌30 min。同时，在培养基中添加氨苄青霉素、卡那霉素各150 mg/L。

1.2.2 LB 取酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g，氢氧化钠调pH至7.0～7.2，在121 ℃下灭菌30 min。

1.3 菌株 金黄色葡萄球菌S.aureus、大肠杆菌E.coli均为本实验室保存。

1.4 试剂 甲醇、无水乙醇、二甲亚砜、浓盐酸、乙酸乙酯、次氯酸钠、硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢均为分析纯，购于昆明仁科商贸有限公司；蔗糖、琼脂粉、卡那霉素、氨苄青霉素、2,2-联苯基-1-苦基肼基、抗坏血酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒均购于上海泰坦科技股份有限公司；水为超纯水。

1.5 仪器 AB135-S电子分析天平(十万分之一)、PL203电子分析天平(千分之一)(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS26电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；SKHG-1MDZAG干燥箱(广州泉能智能科技股份有限公司)；HZP-92恒温培养摇床、HDPN-II-150电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；SW-CJ-1FD超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)；MLS-37811L-PC高压蒸汽灭菌锅(松下健康医疗器械上海有限公司)；R-210旋转蒸发仪(德国Buchi公司)；TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

2 方法

2.1 内生真菌分离纯化 将药材根、茎和叶冲洗干净，在超净工作台时将其置于50%次氯酸钠溶液中浸泡1 min，取出用无菌水冲洗4～5次，再置于75%乙醇中浸泡2 min，取出用无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干水分，去掉消毒过程中暴露的末端，根和茎切成1 cm的小段，叶切成1 cm×1 cm的小块，无菌镊子接种于分装有培养基的培养皿中，每个培养皿中接种5段，在28 ℃下恒温培养3～15 d，每天观察真菌生长情况，待组织边缘长出菌落时，将菌丝转接于新培养皿中纯化4～5次，直至得到形态颜色完全一致的单菌落。将最后一次清洗样品的无菌水作为无菌参照，以保证分离得到的菌株为内生真菌，并且无染菌。纯化后的菌株编号后接种于PDA斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2 内生真菌鉴定

2.2.1 形态 取纯化后的菌株，采用点植法接种于PDA培养皿中心，在28 ℃下恒温培养，待菌丝生长至整个表面后置于载玻片上，在光学显微镜下观察菌落、菌丝体、孢子形态。参照真菌鉴定手册进行初步鉴定[10]。

2.2.2 分子生物学 待纯化的菌株长满整个培养皿后，在无菌状态下挑取菌丝，置于研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状，采用DNA提取试剂盒提取菌株DNA，ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增[11]，委托昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序片段用BLAST软件进行同源性比对，通过MEGA 7.0软件中的邻接法(neighbor-joining methods，NJ)、基于Kimura 2-parameter距离构建菌株系统发育树，并以自展法(bootstrap)进行检测，自展次数设为1 000次。

2.3 抑菌活性研究

2.3.1 菌液制备 挑取适量活化后内生真菌接种于PDB液体培养基中，在28 ℃、135 r/min下培养7 d。在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，超声萃取3次，合并后减压蒸干溶剂得浸膏，真空干燥，制成10.24 mg/mL溶液[二甲基亚砜(DMSO)体积分数不超过5%]，将卡那霉素同法配制成相同质量浓度阳性对照溶液。选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为病原指示菌株，活化后接种于LB培养基中，置于摇床上，在37 ℃、120 r/min下培养16～18 h，吸取20 μL培养液，无菌水稀释至200 mL，菌落个数为1×105～1×106cfu/mL，作为供试菌液。

2.3.2 微量二倍稀释法 在96孔培养板的第1孔中加入90 μL 10.24 mg/mL待测溶液，第2孔中加入100 μL 10.24 mg/mL待测溶液、80 μL空白培养基，第3～8孔中均加入90 μL空白培养基，将第2孔中的溶液充分混匀后取90 μL，加到第3孔中，以此类推，最终第1～8孔均加入稀释供试菌液10 μL，第2～7孔中待测样品质量浓度分别为5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 mg/mL，第1孔中待测样品溶液质量浓度为9.22 mg/mL，仅含稀释后的供试菌液和空白培养基的第8孔作为阴性对照，卡那霉素作为阳性对照(实验结束时，空白培养基和孔均应保持澄清透明，证明灭菌完全，并且操作过程中未出现染菌现象)。将接种好病原指示菌的96孔平板置于37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h后取出，观察各孔菌落生长情况，若浑浊，说明有病原菌生长；若澄清透明，则说明该孔相应的待测物对病原菌有抑制作用，以没有病原菌生长的待测物最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)值[12]。每个样品均作3组平行。

采用CLSI M27-A3中规定的肉眼观察法判定待测样品的MIC值，按照规定在光线充足的中午由2个人同时观察试验结果，并作出判定。将含药试验孔与阳性对照孔、阴性对照孔进行对比，分为5个等级，0级为试验孔肉眼观察清晰，无浑浊现象(100%受抑制)；1级为试验孔肉眼观察略微浑浊(80%受抑制)；2级为试验孔肉眼观察浑浊度明显下降(50%受抑制)；3级为试验孔肉眼观察浑浊度轻微下降；4级为试验孔肉眼观察浑浊度未下降。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除率测定 将浸膏用无水乙醇制成0.5 mg/mL溶液，取1 mL，与3 mL 0.1 mmol/mL DPPH溶液加到10 mL离心管中，室温静置30 min，5 000 r/min离心5 min，在517 nm波长处测定吸光度A1；将1 mL样品溶液与3 mL无水乙醇加到10 mL离心管中，室温静置30 min，5 000 r/min离心5 min后测定吸光度A2；将3 mL DPPH溶液和1 mL超纯水加到10 mL离心管中；室温静置30 min，5 000 r/min离心5 min后测定吸光度A0，以维生素C为阳性对照，重复3次[13]，计算清除率，公式为清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。再将清除率对受试物浓度对数进行非线性回归拟合抑制曲线，计算IC50值。

2.4.2 羟基自由基清除率测定 将浸膏用无水乙醇制成0.5 mg/mL溶液，取1 mL至10 mL离心管中，依次加入1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，摇匀后静置6 min，再加入1 mL过氧化氢溶液，混匀后2 500 r/min离心20 min，在510 nm波长处测定吸光度A1；用超纯水替代过氧化氢溶液，测定吸光度A2；用无水乙醇代替样品溶液，测定吸光度A0，以维生素C为阳性对照，重复3次[14]，计算清除率，公式为清除率=[1-(A1-A2)/A0]× 100%。再将清除率对受试物浓度对数进行非线性回归拟合抑制曲线，计算IC50值。

2.4.3 总还原力测定 采用铁氰化钾还原法[15]。将浸膏用无水乙醇制成0.5 mg/mL溶液，取2.5 mL至15 mL离心管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/mL磷酸盐缓冲溶液(pH=6.6)、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃水浴保温20 min后取出，迅速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，2 000 r/min离心10 min，取上层清液2.5 mL，依次加入2.5 mL超纯水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，摇匀后静置10 min，在700 nm波长处测定吸光度。再将维生素C用无水乙醇制成0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1 mg/mL溶液作为对照，同法测定其吸光度。

3 结果

3.1 内生真菌鉴定 共分离纯化出35株内生真菌，根据菌株的外观形态及微特征初步去除重复，剩余的菌株通过分子生物学进行序列测定并在BLAST中比对，最终获得23株，其中根部11株、叶部9株、茎部3株，归属为7目9科11属。菌株编号Nb 1～Nb 23，见表1。内生真菌系统发育进化分析见图1。

表1 南板蓝根内生真菌分离鉴定Tab.1 Separation and identification of endophytic fungi from B. cusia

图1 基于ITS序列的南板蓝根内生真菌系统发育进化分析Fig.1 Phyogenetic analysis of rDNA-ITS sequences of endophytic fungi from B. cusia

植物内生真菌的分布具有组织偏好性，其种群结构差异明显[16]。在23株内生真菌中，Diaporthe和Fusarium为南板蓝根第一优势属内生真菌，其占比均为21.74%，其中在根部分离得到11株，占总菌株数的47.83%，包括Cladosporium、Fusarium、Xylaria、Setophoma、Purpureocillium、Penicillium，其优势属为Fusarium，占根中总数的45.45%；在茎部分离得到3株内生真菌，占总菌株数的13.04%，包括Diaporthe、Phomopsis，其优势属为Diaporthe，占茎中总数的66.67%；在叶部分离得到9株内生真菌，占总菌株数的39.13%，包括Cladosporium、Nemania、Diaporthe、Penicillium、Aspergillus、Phyllosticta，其优势属为Diaporthe，占叶中总数的33.33%,见图2。

图2 南板蓝根内生真菌分布Fig.2 Distribution of endophytic fungi from B. cusia

3.2 抑菌活性

3.2.1 金黄色葡萄球菌 表2显示，有12株菌的发酵物对金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制活性，其中Nb 6、Nb 12、Nb 19较强。

表2 南板蓝根内生真菌发酵物对金黄色葡萄球菌的抑制活性Tab.2 Inhibitory activities of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia on S.aureus

3.2.2 大肠杆菌 表3显示，有11株菌的发酵物对大肠杆菌有不同程度的抑制活性，其中Nb 2、Nb 7、Nb 19较强。

表3 南板蓝根内生真菌发酵物对大肠杆菌的抑制活性Tab.3 Inhibitory activities of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia on E. coli

3.3 抗氧化活性

3.3.1 DPPH自由基清除率 图3显示，除菌株Nb 16外，其他22株内生真菌发酵物均对DPPH自由基表现出清除活性，其中9株清除率大于50%，以Nb 19、Nb 22、Nb 2较高(分别为89.03%、87.61%、82.25%)，IC50值分别为54.86、59.26、64.02 μg/mL，同时三者分属于Penicillium、Aspergillus、Cladosporium属，并且均来源于叶部。

图3 南板蓝根内生真菌发酵物对DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rates of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia

3.3.2 羟基自由基清除率 图4显示，23株内生真菌发酵物均对羟基自由基表现出清除活性，其中Nb 19、Nb 10、Nb 14较强，清除率分别为53.58%、50.77%、50.24%，IC50值分别为104.80、127.70、109.30 μg/mL，同时三者分属于Penicillium、Nemania、Diaporthe属，并且均来源于叶部。

图4 南板蓝根内生真菌发酵物对羟基自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rates of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia

3.3.3 总还原力 图5显示，23株内生真菌发酵物均具有不同程度的总还原能力，其中Nb 3、Nb 2、Nb 11、Nb 22较强，维生素C当量分别为14.73、13.39、11.26、10.39 mg/L，分属于Fusarium、Cladosporium、Setophoma、Aspergillus属，并且Nb 3、Nb 11来源于根部，Nb 2、Nb 22来源于叶部。

图5 南板蓝根内生真菌发酵物总还原力Fig.5 Total reducing capacities of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia

4 讨论

本研究从南板蓝根中分离出23株内生真菌，其中根部11株，叶部9株，茎部3株，对其进行液体发酵培养，采用二倍稀释法测定抑菌活性，发现Nb 19、Nb 14、Nb 12、Nb 10、Nb 9、Nb 8、Nb 2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有不同程度的抑制活性，占总菌株的34.78%，分属于Penicillium、Diaporthe、Setophoma、Xylaria属，表明其数量和种类均存在差异。Meng等[17]发现，内生真菌PenicilliumbrocaeMA-231中次生代谢产物brocapyrrozins A对金黄色葡萄球菌有抑菌活性；Sousa等[18]发现，苦苣苔属植物中内生真菌Diaporthesp. F2934次生代谢产物膦类化合物A和C对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑菌活性；徐国波等[19]从花蓼内生真菌Diaporthesp.代谢产物中，发现了具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性成分；Ding等[20]发现，分离自喜树的Diaporthesp.和Xylariasp.均具有抗菌活性；Zhou等[21]在对从毛竹中分离的一株Setophomasp.，发现其对多种临床致病菌均有抑制作用。

抗氧化剂可抑制自由基的反应过程或干扰自由基连锁反应的引发与扩散过程[22]，本实验采用DPPH法测定南板蓝根内生真菌清除DPPH自由基的活性，水杨酸法测定清除羟基自由基活性，铁氰化钾法测定总还原能力，从而考察其抗氧化活性。部分内生真菌能参与植物活性成分的合成，可能会产生与宿主植物相似或相同的化合物及其衍生物[23]。Gu等[24]研究表明，从南板蓝根中分得的化合物对金黄色葡萄球菌具有微弱的抑制活性；Li等[25-26]发现，南板蓝根水提物、80%甲醇提取物均表现出微弱的抗氧化活性。经过综合筛选，确定菌株Nb 19、Nb 2中可能存在待研究开发的潜在活性成分，今后可进一步考察两者是否会产生与宿主植物南板蓝根相同或相似的次生代谢产物。