基于网络药理学探讨艾柱燃烧产物保护视网膜损伤的机制

陈如一， 郭 璐， 李萱儒， 徐心如， 夏道宗

(浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

近年来，人们在液晶显示终端上所花费的时间日益增长，发光二极管作为液晶显示屏中主要的背光源，在工作的过程中会发出大量蓝光，进而损伤视网膜。视网膜损伤的病理基础主要是基于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞功能的紊乱、退化和死亡[1]，一方面RPE细胞作为血-视网膜外屏障的重要组成部分，承担着视网膜代谢物质转运、光感受器外节段降解以及保护视网膜免受光损害等重要作用；另一方面，RPE细胞作为人体内耗氧量最大的组织之一，维持其所在部位的氧化还原稳态至关重要[1-2]，但蓝光辐照使RPE内部稳态被打破，体内抗氧化防御系统不足以及时清除体内由蓝光诱导的过量氧自由基，进而引发了机体的氧化应激反应和视网膜损伤。

艾叶为菊科蒿属植物艾ArtemisiaargyiLévi. et Vant.的干燥叶，艾柱是由艾叶加工的艾绒填充而成的柱状物[3]，艾灸治疗眼部疾病、缓解视疲劳自古便有应用[4]，但其具体作用机制尚不明确，药效活性成分和核心靶点蛋白还有待探究。本课题组前期研究表明，艾柱燃烧产物含有苯酚、3-呋喃甲醇等34种成分，具有较强的抗氧化活性[5]；本研究基于网络药理学[6-7]，通过筛选艾柱燃烧产物活性成分作用靶点和视网膜损伤疾病靶点建立药物-靶点-疾病网络，并对艾柱燃烧产物保护视网膜损伤的作用机制进行初步验证，以期为其临床应用提供依据。

1 材料

1.1 细胞株 人视网膜色素上皮细胞ARPE-19购自美国模式培养物集存库，批号CRL-2302。

1.2 试剂与药物 艾柱(批号20190415)购自浙江乾一生物科技有限公司。叶黄素(批号F10J10M92153)购自上海源叶生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司；RIPA 裂解液(强)、蛋白酶抑制剂混合液、磷酸酶抑制剂混合液、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司；p44/42 MAPK(ERK1/2)、phospho-p44/42 MAPK(p-ERK1/2)、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；IRDye 800 CM Goat anti-Rabbit抗体购自美国LI-COR公司。

1.3 数据库 PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；OMIM数据库(https://www.omim.org)；String数据库(https://string-db.org/)；Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

1.4 仪器 Synergy H1型多功能微孔板检测仪(美国BioTek公司)；W201B型数显恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司)；BS224S型电子天平[万分之一，丹佛仪器(北京)有限公司]；5427R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；CLX-1487型双色红外激光成像系[基因科技(上海)有限公司]；Mini-PROTEAN Tetra Cell型垂直电泳系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 艾柱燃烧产物化学成分信息及靶点获取 基于本课题组前期发现的艾柱燃烧产物化学成分信息[5]，通过PubChem数据库获得其对应的靶点蛋白，NCBI数据库将其名称转化为基因名，整理合并后得到艾柱燃烧产物活性成分及其作用靶点。

2.2 “艾柱燃烧产物-活性成分-作用靶点”网络构建 将筛选得到的艾柱燃烧产物活性成分和相关作用靶点分别导入Cytoscape 3.8.0软件中，构建“艾柱燃烧产物-活性成分-作用靶点”网络，以阐述艾柱燃烧产物物质基础。

2.3 视网膜损伤靶点获取 通过检索获得OMIM数据库中与视网膜损伤相关的疾病靶点，取艾柱燃烧产物相关的作用靶点与视网膜损伤疾病靶点的交集，获得艾柱燃烧产物保护视网膜损伤的潜在作用靶点。

2.4 艾柱燃烧产物活性成分-视网膜损伤-靶点网络构建 将艾柱燃烧产物活性成分、交集靶点与视网膜损伤疾病导入Cytoscape 3.8.0软件中，利用软件功能构建艾柱燃烧产物活性成分-视网膜损伤-靶点网络，在网络中艾柱燃烧产物活性成分、视网膜损伤疾病和靶点由节点表示，节点之间的相互关系由边表示。

2.5 蛋白相互作用(PPI)网络构建 将艾柱燃烧产物与视网膜损伤疾病作用靶点导入String数据库中，构建蛋白与蛋白相互作用网络模型，选择物种为“Homosapiens”，设定最低相互作用阈值为低置信度“low confidence(0.150)”，其余参数保持默认设置，最终获得蛋白相互作用网络图。

2.6 GO、KEGG富集分析 将艾柱燃烧产物与视网膜损伤疾病作用靶点导入Metascape数据库，设置物种为“Homosapiens”，进行GO富集分析(包括生物过程、细胞组分、分子功能，P≤0.01)和KEGG信号通路分析(P≤0.05)。通过GO富集分析得到3个部分数据绘制柱状图，KEGG通路富集分析获取艾柱燃烧产物保护视网膜损伤疾病相关通路，并绘制KEGG气泡图，节点大小表示富集到的靶点数量，P值越小，信号通路可信度越高。

2.7 分子对接技术预测艾柱燃烧产物活性成分与潜在靶点结合能力 通过PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获得目标蛋白3D结构(PDB格式)，设置物种为“Homosapiens”，从TCMSP数据库获取潜在活性化合物的3D结构(mol2格式)。利用PyMOL软件(www.pymol.org)去除蛋白质上的溶剂和配体，Autodock tools 1.5.6、Autodock_vina软件进行分子对接，其结果以结合自由能的高低作为活性物质与蛋白质结合程度的评价标准，通常活性物质与蛋白质结合的构象越稳定能量越低，发生的作用可能性越大，对接结果越可靠。

2.8 细胞培养和处理 取含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养ARPE-19细胞，待细胞长到80%时用胰酶消化，取对数生长期的细胞进行后续实验。调整细胞密度2×105/mL，铺板或皿适应12 h后，分为5组，分别为对照组和蓝光组，更换新鲜培养基培养；对照+艾柱燃烧产物组和蓝光+艾柱燃烧产物组，换用含2 μg/mL艾柱燃烧产物的培养基培养；蓝光+叶黄素(阳性对照)组，换用含30 μmol/L叶黄素的培养基培养。药物预处理24 h后，在LED蓝光源(430 nm、96.1 W/m2)下光照1 h，得到蓝光诱导的ARPE-19细胞损伤模型，用于后续实验。

2.9 Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的表达 取对数生长期的ARPE-19细胞，接种于直径10 cm细胞培养皿中，按“2.8”项下方法分组及处理后收集细胞，细胞裂解后提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，加入适量上样缓冲液，100 ℃下恒温金属浴变性10 min，得到蛋白样本，再进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，加入一抗ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK，稀释比例均为1∶1 000，置于4 ℃冰箱中，摇床上孵育过夜，以GAPDH(稀释比例1∶5 000)为内参，TBST洗膜3次后，加荧光标记的二抗(稀释比例为1∶10 000)，室温下避光孵育2 h，TBST洗膜3次后，用LI-COR Odyssey CLx双色红外激光成像系统显影，分析对比条带强弱。

3 结果

3.1 艾柱燃烧产物活性成分 共得到16种艾柱燃烧产物活性成分和619个潜在作用靶点，见表1。

表1 艾柱燃烧产物活性成分Tab.1 Active MSE components

3.2 艾柱燃烧产物活性成分及其靶点相互作用的网络图 图1显示，方形阵列的为药物作用靶点，环状排列的为艾柱燃烧产物的活性成分，每条边代表活性成分与靶点间的相互作用关系；艾柱燃烧产物中麦芽酚、油酸、乌洛托品等主要成分连接的靶点较多，与CASP7、RORC、CASP3、GBA等潜在靶点相互作用密切。

图1 艾柱燃烧产物活性成分及其靶点相互作用的网络图Fig.1 Network diagram for interactions among active MSE constituents and their targets

3.3 视网膜损伤靶点 在OMIM数据库中以“Retina damage”为关键词进行检索，将视网膜损伤靶点合并，剔除重复项，最终得到524个。

3.4 艾柱燃烧产物靶点与视网膜损伤相互作用的网络图 将619个艾柱燃烧产物活性成分靶点基因与524个视网膜损伤靶点基因取交集，得到17个艾柱燃烧产物作用于视网膜损伤的靶点。通过Cytocsape 3.8.0软件构建艾柱燃烧产物靶标与视网膜损伤相互作用的网络，见图2，其中圆形(蓝色)代表疾病，正六边形(绿色)代表药物，正三角形(黄色)代表有效活性成分，倒三角形节点(红色)表示主要靶点，节点间相互作用关系用边表示。由此可知，艾柱燃烧产物能通过多成分、多靶点联合调节的方式治疗视网膜损伤。

图2 艾柱燃烧产物靶点与视网膜损伤相互作用的网络图Fig.2 Network diagram for interactions among MSE targets and retinal damage

3.5 PPI网络 艾柱燃烧产物与视网膜损伤作用的相关靶点共17个，将其上传至String数据库，构建蛋白相互作用网络，见图3，其中节点表示蛋白，边表示功能相关性，共包括17个节点、36条边，平均节点数为4.24，平均局部聚类系数为0.732。通过基因相互连接次数选取Degree值较高者作为核心基因，前5位分别为前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、转录因子AP-1(transcription factor AP-1, JUN)、溶酶体酸性葡萄糖神经酰胺酶(lysosomal acid glucosyl ceramidase, GBA)、酪氨酸受体激酶(tyrosine-protein kinase Lck, LCK)、碱性磷酸酶组织非特异性同工酶(alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme, ALPL)，同时它们也是调节视网膜结构与功能的关键因子。

图3 艾柱燃烧产物靶点蛋白的PPI网络Fig.3 PPI network of MSE target protein

3.6 GO富集分析 将17个艾柱燃烧产物与视网膜损伤作用的相关靶点导入Metascape数据库进行GO功能分析,共得到286个富集结果(P<0.01)，其中生物过程(biological process, BP)240项，主要涉及衰老、对糖皮质激素的反应、对皮质类固醇的反应、去磷酸化、对维生素D的反应等；细胞组成(cellular component, CC)9项，主要涉及转录因子AP-1复合体、核被膜、核纤层蛋白丝、细胞外面上细胞器、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合体等；分子功能(molecular function, MF)37项，主要涉及cAMP反应元件结合、DNA结合转录激活物活性，核受体的激活、转录因子活性，直接配体调控序列特异性DNA结合、磷酸酶激活等。根据-LogP值进行排序，分别在生物过程、分子功能、细胞组分中选出排名靠前的条目，见图4。

图4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

3.7 KEGG富集分析 利用Metascape数据库进行KEGG富集分析，设置P<0.05，筛选出与艾柱燃烧产物保护视网膜损伤相关的信号通路，结果见图5，可知核心靶点JUN主要富集到Th17细胞分化信号通路(图6)。再根据P值进行排序，前20条KEGG通路及其相关信息见表2。

图5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

图6 Th17细胞分化富集分析Fig.6 Enrichment analysis for Th17 cell differentiation

表2 KEGG通路分析(前20)Tab.2 KEGG pathway analysis(top 20)

3.8 分子对接验证 PPI中具有较高Degree值的节点，被认为是关键靶点，本实验对关键靶点JUN的上游蛋白ERK1/2、p38 MAPK进行研究，将两者与16种艾柱燃烧产物活性成分进行分子对接验证，结果见表3。就分子对接而言，结合能越小，表明活性物质与蛋白质之间结合的越牢固，其数值小于-4.25 kcal/mol时表示活性物质与蛋白质之间有一定结合活性，小于-5.0 kcal/mol时有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol时有强烈的结合活性[8]。由此可知，活性成分与关键靶点之间的结合能介于-8.6～-3.7 kcal/mol之间，表明艾柱燃烧产物活性成分与核心靶点JUN上游蛋白之间具有较好的结合活性，预测结果可靠。选取4个对接能量较小者进行展示，结果见图7。

图7 艾柱燃烧产物活性成分与关键靶点JUN上游蛋白的分子对接模式Fig.7 Molecular docking patterns for active MSE components and upstream proteins of core JUN targets

表3 艾柱燃烧产物活性成分与核心靶点JUN上游蛋白的分子对接结果Tab.3 Molecular docking results of active MSE components and upstream proteins of core JUN targets

3.9 艾柱燃烧产物对蓝光诱导ARPE-19细胞中JUN上游ERK1/2、p38 MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 图8显示，与对照组比较，对照+艾柱燃烧产物组ARPE-19细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达无明显变化(P>0.05)；经蓝光照射后，ARPE-19细胞中p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.01)；与蓝光组比较，蓝光+艾柱燃烧产物组和蓝光+叶黄素组p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达均降低(P<0.05，P<0.01)。

注：A为对照组，B为对照+艾柱燃烧产物组，C为蓝光组，D为蓝光+叶黄素组，E为蓝光+艾柱燃烧产物组。与对照组比较，**P<0.01；与蓝光组比较，#P<0.05，##P<0.01。图8 艾柱燃烧产物对蓝光诱导ARPE-19细胞中ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达的影响Fig.8 Effects of MSE on protein expressions of ERK1/2 and p38 MAPK in blue light-induced ARPE-19

4 讨论

近年来随着各类电子设备的普及，视网膜损伤的发病率日益增高，表现为眼部酸胀、疼痛、视物模糊、眼睛干涩等眼部疾病，中医称其为“肝劳”[9]。艾灸在治疗视网膜损伤方面表现出良好的受众基础和临床疗效。为了阐释艾柱燃烧产物活性成分对视网膜损伤的保护作用，本研究通过网络药理学、分子对接、体外细胞实验相结合的研究方法，对其可能的作用机制进行了分析。

通过综合分析艾柱燃烧产物活性成分靶点网络和分子对接，发现艾柱燃烧产物关键化合物主要为油酸、麦芽酚和乌洛托品等。其中，油酸是一种单不饱和脂肪酸，能预防由高脂血症引起的视网膜损伤[10]；麦芽酚是一种天然的芳香化合物，具有较强的自由基清除能力，能抑制H2O2作用下NF-κB核转录因子的磷酸化，从而保护大鼠视网膜神经节细胞免受氧化应激的损伤[11]；乌洛托品作为一种具有抗生素活性的杂环有机化合物，可能在艾灸过程中起到一定的消毒杀菌作用[12]。

蛋白互作网络显示，艾柱燃烧产物保护视网膜损伤的靶点涉及CASP7、RORC、GBA、ATF6等。其中，caspase-7(CASP7)是哺乳动物细胞caspase家族中参与细胞凋亡执行的成员，在损伤诱导的RGC细胞死亡中发挥关键作用，抑制其活性是青光眼和其他视网膜神经退行性疾病的新治疗策略[13]；维甲酸相关孤儿核受体(RORC)是一种重要的T细胞转录调控因子，它在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)的进程中会发生动态甲基化改变，通过调控这种动态的甲基化过程可对其进行治疗[14]；GBA是一种与帕金森疾病密切相关的基因，帕金森病患者视觉障碍与其的突变有关[15]；激活转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)是6种会导致全色盲(achromatopsia, ACHM)的基因之一，其突变或者多组等位基因的删除会引发视力下降，甚至全色盲，外源性激活药物可能通过促进ATF6从内质网到高尔基体的转运来帮助其恢复活性，进而纠正视力损伤[16]。

通过Metascape数据库进行KEGG信号通路富集分析，发现艾柱燃烧产物治疗视网膜损伤的关键通路涉及Th17细胞分化、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等。其中，Th17细胞是一种以表达转录因子RORC为特征的淋巴细胞亚群，在自身免疫性疾病的发生机制中发挥重要作用[17]，体外的小分子化合物能通过调节其免疫应答来诱导Treg细胞改善实验性EAU[18]；IL-17RA作为IL-17信号通路的主要受体，当RPE细胞处于氧化应激状态时能抑制其蛋白表达，可预防氧化应激诱导的RPE细胞凋亡和炎症反应[19]；NF-κB是一种快速诱导的转录因子，在基因诱导的疾病细胞反应中发挥着广泛作用，尤其是在免疫系统中[20]，ROS介导其激活后，可直接调控Ascl1表达和成纤维细胞重编程为化学诱导的光感受器样细胞，在视网膜变性小鼠模型中部分恢复瞳孔反射和视觉功能[21]。

采用分子对接技术将艾柱燃烧产物活性成分与关键靶点JUN上游ERK1/2、p38 MAPK蛋白进行结合能力预测，发现麦芽酚、石竹素、叉明草素、豆甾醇与2种蛋白均具有良好的结合活性。同时，结合蓝光诱导ARPE-19细胞损伤模型对具有结合活性的ERK1/2、p38 MAPK靶点进行验证，发现艾柱燃烧产物组两者蛋白表达均降低，表明艾柱燃烧产物能通过作用于JUN上游ERK1/2、p38 MAPK信号通路来拮抗视网膜损伤发生发展。此外，本研究基于前期实验结果发现，虽然艾柱在燃烧后成分组成发生了很大变化，但其作用于视网膜损伤疾病的靶点却与艾柱挥发油基本相同，表明通过网络药理学来研究中药在燃烧或炮制过程中化学成分的变化及作用靶点的改变是有价值的，可更明确是哪些活性物质及靶点在疾病治疗过程中起到核心作用。