液相色谱-串联质谱法测定中药材浙八味中30 种有机磷农药残留

虞 淼, 姚 芳, 张 寒, 王 娇, 齐沛沛, 王新全*,

(1. 浙江省植保检疫与农药管理总站，杭州 310004；2. 绍兴市上虞区质检计量测试所，浙江 绍兴 312300；3. 浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，杭州 310021)

中草药在我国有着悠久的历史，延胡索(Rhizoma Corydalis)、白芍 (Radix Paeoniae Alba)、白术 (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)、杭白菊 (Dendranthema Morifolium)、麦冬 (Radix Ophiopogonis)、玄参 (Radix Scrophulariae)、郁金(Radix Curcumae) 和浙贝母 (Bulbus Fritillariae Thunbergii) 是浙江省最负盛名的八味道地中药材，称“浙八味”。近年来，浙八味在传统医药乃至现代医学、食品、保健品、化妆品行业展现出广阔的应用前景[1-3]。随着需求量增大，人工种植面积也不断扩张。在种植过程中，使用杀虫剂以防止植株被害虫啃食而影响品质和产量[4]，然而，在浙八味上登记的农药品种极其有限，目前仅菊花和白术上分别有乙酰甲胺磷和二嗪磷登记[5]，这使得植株发生虫害时可用药物少或无，不规范使用农药情况时有出现[6]，其中有机磷农药毒死蜱和甲胺磷等已被违规应用于浙八味作物上[7]。农药残留问题不仅关系到患者的健康，而且关系到我国名贵药材出口。因此，为了更有效监测浙八味中该类农药残留情况，建立一种同时适用于浙八味中有机磷农药残留快速、精准的检测方法至关重要。

浙八味中农药残留分析的前处理方法主要有固相萃取[8]、中空纤维液相微萃取[9]、基质固相分散萃取[10]等。近年来，QuEChERS 方法因其简单、快速的优势被广泛应用于农药残留检测技术中[11-12]，但目前尚无可以同时检测8 种基质中有机磷农药残留前处理方法，因此本研究拟针对浙八味基质的复杂性，通过改进QuEChERS 建立一种普适性的前处理方法。由于浙八味中都含有大量的复杂成分，在萃取过程中往往伴随着目标化合物一同被萃取，使用传统的QuEChERS 方法不能有效降低这些复杂成分的干扰，同时也影响目标化合物的准确分析。因此，如何改进传统的Qu-EChERS 方法应用于浙八味，分散固相萃取 (d-SPE)净化过程中净化吸附剂的选择就变得尤为关键。浙八味中均含有挥发油成分，他们的有效成分有生物碱[13]、黄酮[14-15]、甾醇[16]、萜类[17]以及有机酸[18]和多糖 (甘露糖和半乳糖)[19]等。针对这些复杂成分，选取nano-ZrO2对萃取溶液进行净化。根据文献报道，nano-ZrO2可以在高油基质中吸附脂肪酸、羧酸、甾醇等杂质[20]。ZrO2是两性氧化物，同时具有酸性和碱性位点，因此可吸附酸性及碱性杂质[21]。而nano-ZrO2又具有纳米材料比表面积大、吸附容量大等特点。将其应用于浙八味中可有效针对不同基质中的化学成分对其酸性或碱性杂质进行吸附，达到满意的除杂效果。此外，由于8 种中药材中延胡索、玄参、菊花、郁金中均含有明显的色素成分，查阅文献得知，介孔分子筛MCM-41 对酸性[22]和碱性[23]染料都有吸附作用，因此本研究尝试使用MCM-41 结合nano-ZrO2对基质的色素进行去除，探索其对杂质的净化效果。

本研究选取30 种有机磷农药为研究对象，以延胡索为浙八味的代表基质，采用检测速度快而灵敏的液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 进行分析，建立了可同时测定30 种有机磷农药 (OPPs)的检测方法。通过nano-ZrO2和MCM-41 作为净化吸附剂对样品净化，并将建立的方法应用于8 种基质上验证其在浙八味中的适用性。

1 材料与方法

1.1 药剂、试剂、材料与仪器

30 种有机磷农药标准品均购于上海农药研究所或农业部环境保护科研监测所；Nexera X2 LC-30AD 超高效液相色谱仪及8050 三重四极杆质谱仪购自日本岛津公司；Vortex 涡旋仪购自德国IKA 公司；Biofuge primo R 高速离心机购于德国Thermo 公司；Filter Unit 滤膜 (0.22 μm) 购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。乙腈和甲醇 (色谱级)购于德国Merck 公司；色谱级甲酸铵购于美国Tedia 公司；纳米材料二氧化锆 (nano-ZrO2) 和介孔分子筛 (MCM-41) 购于江苏先丰纳米材料科技有限公司；无水硫酸镁 (MgSO4) 及氯化钠 (NaCl)购于天津博纳艾杰尔科技有限公司；试验用水为Milli-Q 超纯水系统制备的超纯水 (美国Millipore公司) 。

玄参、延胡索和麦冬粉末购于百姓中药材市场；白芍、浙贝母、郁金、白术的根茎样品购于杭州中药材市场；杭白菊样品采自于浙江省桐乡市。供实际样品检测的中药材均购于杭州中药材市场；样品经粉碎机高速研磨成粉末状，避光保存至干燥器中备用。

1.2 检测条件

色谱条件：ACE Excel C18色谱柱 (100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)；柱温35 ℃；流动相为5 mmol/L甲酸铵水溶液 (A) 和甲醇 (B)，梯度洗脱程序：0 min，20% B，12 min 时升至90% B，维持到14 min 后，4 min 内降至20 % B，总时间为18 min；流速0.3 mL/min；进样量为2 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源正离子 (ESI+)模式；多反应监测 (MRM)；离子化电压4000 V；加热块温度400 ℃；有机磷农药的定性定量离子对等信息见表1。

表1 30 种有机磷农药多反应监测分析参数Table 1 MRM parameters for residue analysis of 30 OPPs

续表1Table 1 (Continued)

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取 准确称取样品2 g (±0.05 g)于50 mL 离心管中，加入8 mL 水，涡旋1 min，再加入4 mL 乙腈，涡旋1 min；加入1.5 g NaCl和4.0 g 无水MgSO4，涡旋1 min，于7000 r/min下离心5 min；收集上清液，待净化。

1.3.2 样品净化 准确移取待净化液1 mL 于含有30 mg nano-ZrO2、50 mg MCM-41 和150 mg 无水MgSO4的2 mL 离心管中，剧烈振荡1 min 后，于7000 r/min 下离心5 min；取上清液，过0.22 μm滤膜并定容至2 mL，待测定。

1.4 方法确证

1.4.1 标准储备溶液配制及标准曲线绘制 分别称取一定量的30 种有机磷标准品，用甲醇溶解，分别配制成各农药一定浓度 (800～1500 mg/L) 的单标储备液。分别准确移取一定量的各单标储备液于25 mL 容量瓶中，用甲醇稀释，配成质量浓度为10 mg/L 的混合农药标准储备液，于4 ℃保存。用乙腈或经提取净化后的空白提取液稀释混合农药标准储备液，配成0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.25 mg/L 的系列溶剂标准工作液或基质匹配标准工作液，以目标化合物质量浓度为横坐标 (x)，对应的峰面积为纵坐标 (y)绘制标准曲线。

1.4.2 基质效应 材料优化试验中，计算基质匹配标准溶液峰面积与溶剂标准溶液峰面积的比值(Ra)，作为评价基质效应[11,24]的主要指标。若Ra=1，则不存在基质效应，若Ra< 1，则存在基质抑制效应，Ra值越小抑制作用越强；若Ra> 1，则存在基质增强效应，Ra值越大增强作用越强；在方法确证过程中，通过基质标准曲线线性方程和溶剂标准曲线线性方程斜率比来评价基质效应[25]。斜率比为1，代表没有基质效应；斜率比小于1 表示基质抑制效应；斜率比大于1 表示基质增强效应。

1.4.3 添加回收试验 向空白延胡索基质样品中添加30 种有机磷农药混合标准溶液，设置0.01、0.05 和0.1 mg/kg 3 个添加水平，每个水平3 次重复，另设空白对照。其余7 种浙八味空白样品中添加30 种有机磷农药混合标准溶液，设置0.05 mg/kg添加水平，重复3 次，另设空白对照。添加后混匀静置30 min 后进行样品前处理，按1.2 节的条件测定，计算平均回收率及相对标准偏差 (RSD)。

2 结果与分析

2.1 净化材料的选择

通过预试验表明，用乙腈提取样品中的有机磷农药，可以确保农药完全从样品中萃取出来，同时也能降低亲脂性物质对结果的影响[26]。4 mL乙腈既能保证萃取效率，又能节约有机溶剂用量，在建立快速前处理方法的同时又降低了方法的定量限。因此，本试验将4 mL 乙腈作为该方法的萃取溶剂。

以延胡索作为代表样品，在0.04 mg/kg 添加水平下，设置不同梯度的nano-ZrO2用量 (10、20、30、40 和50 mg) 来探究其最佳用量。1 mL乙腈萃取液经过不同量nano-ZrO2和150 mg 无水MgSO4的净化除水后，通过LC-MS/MS 分析。由图1 可知，nano-ZrO2用量为10 和20 mg 时，多数农药的回收率偏高，所有农药的回收率在95%～124% 和95%～129% 之间。当用量增加到30 mg 时，回收率降到了较好的范围 (92%～116%，RSDs ≤ 10%) 。而当用量继续增加时，回收率又呈现上升的趋势。因此选择nano-ZrO2用量为30 mg。

图1 延胡索中30 种有机磷农药在不同nano-ZrO2 用量条件下的回收率(n = 3)Fig. 1 Recoveries of pesticides in Rhizoma Corydalis using different amount of nano-ZrO2 as sorbents (n = 3)

延胡索样品中含有大量色素，影响对检测结果的准确定量，而nano-ZrO2对色素的吸附效果不佳，因此选择有效吸附色素的材料是很有必要的。本研究选择介孔分子筛MCM-41，探究其对延胡索中色素的去除效果以及对回收率和基质效应的影响。1 mL 乙腈萃取液经不同用量的MCM-41 (0、10、20、30、40 和50 mg)、30 mg nano-ZrO2和150 mg 无水MgSO4净化除水后，经LCMS/MS 分析。结果 (图2) 表明：随着MCM-41 用量增加，样品颜色逐渐变浅，证明该材料对延胡索中色素有去除效果；使用不同用量的MCM-41 对应的回收率范围分别为87%～129% (0 mg)，80%～122% (10 mg)，83%～122% (20 mg)，81%～125% (30 mg)，88%～117% (40 mg)，89%～113% (50 mg)，由此可知，随着MCM-41 用量的增加，回收率范围逐渐缩小，40 mg 和50 mg 均可满足要求。

图2 延胡索样品经不同MCM-41 用量和30 mg nano-ZrO2 净化后颜色的变化Fig. 2 The color change of the Rhizoma Corydalis samples after cleaned-up with different amount of MCM-41 and 30 mg nano-ZrO2

9 种农药 (哒嗪硫磷、敌瘟磷、甲拌磷、马拉硫磷、马拉氧磷、三唑磷、杀虫畏、杀扑磷、亚胺硫磷) 在不同用量的MCM-41 下基质效应无明显改善。其余21 种农药的基质效应见图3，除氧乐果、敌敌畏、丙溴磷外，其余18 种农药随着MCM-41 用量增加，基质抑制作用逐渐减弱。因此本研究选择MCM-41 最佳用量为50 mg。

图3 不同用量MCM-41 对部分农药基质效应的影响 (nano-ZrO2 的用量为30 mg)Fig. 3 The effect of different amount of MCM-41(with 30 mg nano-ZrO2) on matrix effects

2.2 方法确证

2.2.1 线性关系、灵敏度和基质效应 结果 (表2)显示，30 种有机磷中苯腈磷和敌百虫在0.002～0.25 mg/L 范围内呈线性，敌敌畏在0.005～0.25 mg/L范围内呈线性，其余27 种农药均在0.001～0.25 mg/L范围内具有良好的线性关系，且线性相关系数均大于0.99。以3 倍信噪比所对应的化合物质量浓度确定为检出限 (LOD)，则本研究中30 种有机磷农药在延胡索中的LOD 为0.00013～0.0026 mg/L。

各化合物的基质效应在0.12～0.81 范围内 (表2)，说明各分析化合物在延胡索基质中呈现基质抑制效应。虽然本试验在优化过程中对基质效应有一定的改善，但仍然对准确定量带来影响，建议用基质匹配标准溶液进行定量分析。

表2 延胡索中30 种有机磷的回归方程、相关系数、基质效应、线性范围及检出限Table 2 The linearity regression equation, correlation coefficients, matrix effects, linear range,and LODs of the 30 OPPs in Rhizoma Corydalis

2.2.2 方法的正确度及精密度 在0.01、0.05 和0.10 mg/kg 添加水平下，各农药的回收率结果见表3。除敌敌畏在0.010 mg/kg 的添加水平下未检出外，其余农药的回收率范围在79%～117%，RSD 小于17%。根据欧盟文件SANTE/12682/2019 规定[27]，定量限 (LOD) 为试验中最低添加水平并且回收率满足工作需求。本试验的最低添加水平为0.01 mg/kg，除敌敌畏未检出外，其余29 种农药的回收率为81%～107%，故方法中这29 种农药的LOQ 为0.010 mg/kg。而敌敌畏在添加水平为0.05 mg/kg 时，回收率为103%，所以敌敌畏在本方法中的LOQ 为0.05 mg/kg。

表3 延胡索中30 种有机磷在不同添加水平下的回收率及相对标准偏差(n = 3)Table 3 Recoveries and RSDs of the 30 OPPs in Rhizoma Corydalis at different spiking levels (n = 3)

2.3 方法适用性验证

进一步对浙八味中其余7 种中药材进行方法适用性验证。采用建立的方法对玄参、白芍、浙贝母、郁金、白术、麦冬、杭白菊进行添加回收试验，添加水平设为0.05 mg/kg，各农药在不同基质中的平均回收率及RSD 见表4。结果表明，倍硫磷在郁金和杭白菊两种基质中未检出，敌敌畏在玄参、郁金和麦冬中未检出，氧乐果和乙酰甲胺磷的回收率在64%～71%之间，其余农药在8 种基质中的回收率均介于70%～130%之间。分析8 种基质空白样品色谱图发现 (见附加材料S1)，郁金、麦冬、杭白菊和玄参空白基质背景干扰峰较多，致使倍硫磷在郁金和杭白菊基质标准溶液中无法准确定量 (见附加材料S2)；敌敌畏在玄参、郁金和杭白菊基质标准溶液中无法准确定量 (见附加材料S3)。以上说明浙八味中药基质的不同，对倍硫磷和敌敌畏检出的影响较大。

表4 白芍、浙贝母、玄参、郁金、白术、麦冬和杭白菊中30 种有机磷在添加水平为0.05 mg/kg 下的回收率 (n = 3)Table 4 Recoveries of the 30 OPPs in Radix Paeoniae Alba, Bulbus Fritillariae Thunbergii, Radix Scrophulariae, Radix Curcumae, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Radix Ophiopogonis, and Dendranthema Morifolium samples at spiked concentration of 0.05 mg/kg (n = 3)

2.4 实际样品测定

采用本研究建立的方法对购自市场的30 份中药材样品进行检测，结果见表5。共有15 个样品检出5 种有机磷农药残留，涉及浙贝母、麦冬和杭白菊3 种中药材，其中毒死蜱和丙溴磷在麦冬和杭白菊中检出率较高，辛硫磷在浙贝母中检出，马拉硫磷和三唑磷在杭白菊中检出。其余白芍、玄参、郁金、白术和延胡索5 种中药材均未检出有机磷农药。

表5 实际样品中农药残留的测定结果Table 5 The pesticide residues in real samples

3 结论

本研究建立了液相色谱-串联质谱测定浙八味中30 种有机磷农药残留的分析方法。本方法通过改良的QuEChERS 前处理技术，选取两种吸附材料nano-ZrO2和介孔分子筛MCM-41 组合作为净化吸附剂，对浙八味延胡索基质中杂质和色素有一定的去除效果。通过系统的方法验证表明，除苯腈磷、敌百虫 (0.002～0.25 mg/L) 和敌敌畏(0.005～0.25 mg/L) 外，其余27 种农药在0.001～0.25 mg/L 范围内线性良好，相关系数 (r) 均大于0.99。本方法检出限 (LOD) 在0.00013～0.0026 mg/L 之间，定量限 (LOQ) 除敌敌畏 (0.050 mg/kg)外，均为0.01 mg/kg。该方法的准确度和精密度满足需求，除倍硫磷和敌敌畏外，其余28 种农药在浙八味中均有很好的适用性。此方法为浙八味中有机磷农药残留分析提供了新的方法依据，具有良好的应用前景，为浙八味的日常监控、残留限量制定及风险评估等提供了可靠的分析手段。