生防枯草芽孢杆菌HMB19198 发酵培养基的筛选及优化

曲远航, 郭庆港*,, 李社增, 宣立锋, 张晓云, 马 平

(1. 河北省农林科学院 植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，河北 保定 071000；2. 河北省农林科学院 石家庄果树研究所，石家庄 050061)

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis及其近源菌种由于能产生多种抑菌活性物质，并且能形成耐逆、抗热的芽孢而利于制剂的研制，因此成为了开发微生物源杀菌剂的重要资源[1-2]。目前防治作物土传病害的微生物源杀菌剂制剂多为可湿性粉剂和干粉种衣剂，这些制剂加工过程中的瞬时高温易杀死以营养体形态存在的菌体，而以芽孢形态存在的菌体则可能存活。因此，在考查微生物发酵指标时，既要考虑菌体的数量，还应考虑耐热芽孢的浓度[3]。理想的发酵体系首先应能提高菌体的发酵水平，其次还能通过营养物质调控和环境条件的改变使菌体最大可能地转化为耐逆性强的芽孢[4]。枯草芽孢杆菌菌体生长和芽孢的形成受多种因素影响，而培养基中的碳源和氮源是其主要影响因素，充足的碳源和氮源可促进菌体的生长，但芽孢的形成则一般发生在营养匮乏等逆境情况下[5]。由于不同菌株对适合自身菌体生长和芽孢形成所需的营养物质不同，因此，针对某一特定菌株，需要探索其特定的最适营养物质组成。

对于防治气传病害的微生物源杀菌剂，除了考虑菌体数量和活芽孢数量外，还要考虑其活性成分的含量。枯草芽孢杆菌类细菌产生的活性物质主要是脂肽类抗生素，包括泛革素 (fengycin) 、表面活性素 (surfactin) 和依枯草素 (iturins) ，其中泛革素对多种植物病原菌具有较强的抑制活性，在植物病害防治中发挥着重要作用。Islam 等[6]鉴定出枯草芽孢杆菌C9 菌株产生的主要抗真菌物质为泛革素，并通过单因素试验发现以甘露醇为碳源、以黄豆粉为氮源时泛革素的产量最高。Yaseen等[7]则发现，不同碳源和氮源会影响泛革素启动子的表达，以尿素或尿素和铵盐的混合物为氮源、以甘露醇为碳源时，可以提高泛革素启动子的活性，从而提高其产量。

目前工业化的细菌培养基原料主要包括糖类、玉米粉、淀粉、各种油料作物饼粉和鱼粉等农副产品，以及铵盐、硝酸盐和钾、钠、镁等矿物质元素。其中葡萄糖、糖蜜、淀粉及玉米粉主要提供碳源，豆饼粉、鱼粉、铵盐和硝酸盐主要提供氮源。钟蔚[8]通过单因素筛选试验发现，以麦芽浸粉作为碳源时，枯草芽孢杆菌BS1 菌株芽孢浓度最高；以黄豆粉作为氮源时，虽然芽孢浓度较低，但由于菌体浓度大，所以其芽孢产量仍远高于其他氮源条件下的芽孢产量，因此仍可作为最适氮源用于BS1 菌株的发酵。也有研究报道，红糖、淀粉和葡萄糖可作为枯草芽孢杆菌的最佳碳源，而花生饼粉、豆粕、酵母浸粉及牛肉膏可作为枯草芽孢杆菌的最佳氮源[9-12]。由此可见，不同菌株适宜的最佳碳源和氮源各不相同。

枯草芽孢杆菌HMB19198 菌株是河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室分离获得的一株生防细菌，已证明以其为活性成分的微生物菌剂能有效防治番茄灰霉病和瓜类白粉病，且该菌株可产生脂肽类抗生素泛革素和表面活性素等活性物质，其中泛革素是主要的抑菌活性物质[13]。为提高HMB19198 菌株的发酵水平，降低相关菌剂的生产成本，本研究以活芽孢浓度为指标，首先从工业生产常用培养基中筛选出较适合HMB19198 菌株芽孢形成的基础配方，并进一步对碳源和氮源进行筛选及优化，结合Plackett-Bruman 设计与响应曲面分析 (RSA) ，获得到了利于HMB19198 菌株芽孢形成的发酵培养基。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养条件

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisHMB19198 菌株，由河北省农林科学院植物保护研究所分离和保存，中国微生物菌种保藏中心保藏编号为CGMCC No. 5613，于−80 ℃长期保存在含有体积分数30%甘油的LB 培养基 (胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5 g/L) 中，使用前在LB 固体培养基上于37 ℃进行活化。

1.2 芽孢浓度测定

取1 mL 菌液，于80 ℃高温处理10 min，之后用灭菌水系列稀释，分别取100 μL 10−4和10−5稀释倍数的菌悬液，涂布于LB 固体培养基上，于30 ℃培养过夜，统计芽孢浓度。以未经高温处理的菌悬液为空白对照，并按式 (1) 计算芽孢的形成率[14]。

式中：SR 为芽孢形成率，%；TC 为80 ℃高温处理组菌落数，CFU/mL；UC 为空白对照组菌落数，CFU/mL。

1.3 基础培养基筛选

根据文献报道[7,15-18]，选择8 种常用于芽孢杆菌的培养基 (标号1 ～ 8) 作为HMB19198 菌株的基础培养基 (表1) 。将活化好的HMB19198 菌株接种于5 mL LB 培养基中，37 ℃、160 r/min 振荡培养12 h后，按照1 : 100 的比例接种于100 mL 各基础培养基中，37 ℃、160 r/min 振荡培养48 h，筛选发酵液中芽孢浓度最高的培养基作为HMB19198 菌株的基础培养基。基础培养基配方信息详见表1。

表1 芽孢杆菌基础培养基Table 1 Basic mediums for Bacillus

1.4 最适碳源及氮源筛选

在筛选出利于HMB19198 菌株芽孢形成的基础培养基基础上，采用单因素试验方法，选取12种碳源 (麦麸粉、水解玉米粉、玉米粉、糖蜜、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、可溶性玉米淀粉和苹果酸) 及10 种氮源 (豆饼浸粉、酶解玉米浆、花生饼浸粉、棉籽饼粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、鱼粉、黄豆粉和硫酸铵) ，以30 g/L质量浓度分别替换基础培养基中的碳源和氮源。按照1.2 节所述方法测定发酵液中芽孢浓度，筛选利于HMB19198 菌株芽孢形成的最佳碳源和氮源。

1.5 Plackett-Burman 法分析培养基中影响菌株芽孢形成的主要因子

Plackett-Burman 法是一种近饱和的两水平试验设计方法，该方法能通过最少试验次数快速筛选出影响某一性状的主要因子[19]。本研究利用Plackett-Burman 法对利于HMB19198 菌株芽孢形成的碳、氮源进行优化，每个因素分别取低水平“−1”和高水平“1”两个水平，采用 Minitab 软件进行方差分析。具体试验因子及水平见表2。

表2 Plackett-Burman 试验因子与水平设计Table 2 Experimental design of the factors and levels of Plackett-Burman

1.6 响应曲面分析法确定发酵液芽孢浓度最高时的培养基配方

响应曲面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法[19]。在Plackett-Burman 分析的基础上，以可溶性玉米淀粉、糖蜜、花生饼浸粉、K2HPO4•3H2O 为参考因子，以发酵液中芽孢浓度为指标，采用Design-Expert 软件按照Boxbehnken 中心组合设计4 因子、3 水平、29 次运行的响应曲面试验。具体试验因子及水平见表3。通过对结果数据进行二次回归拟合，最后在一定的水平范围内求出最佳值。

表3 响应曲面试验因子与水平设计Table 3 Experimental design of the factors and levels of RSA

1.7 枯草芽孢杆菌HMB19198 菌株生长曲线测定

按照优化后的配方配制优化培养基，以基础培养基为对照进行摇瓶培养。将过夜培养的HMB19198 菌株按照1 : 100 的比例分别接种到优化培养基和基础培养基中，于37 ℃、160 r/min 下振荡培养，每隔2 h 取样统计发酵液中芽孢浓度，计算芽孢形成率，并绘制生长曲线。

1.8 优化培养基中发酵液所产泛革素浓度测定

将HMB19198 菌株分别以优化培养基和基础培养基于37 ℃、160 r/min 下振荡培养48 h，获得菌株发酵液；发酵液于4 ℃、10000 r/min 下离心20 min，收集上清液；用6 mol/L 盐酸溶液调节上清液pH 值至2.0，4 ℃下过夜，次日于10000 r/min下离心20 min，收集沉淀；沉淀干燥后加入甲醇抽提2 次，合并抽提液得到脂肽粗提物。

采用高效液相色谱 (HPLC) 梯度洗脱分离脂肽化合物。HPLC 分析系统为 AKTA Purifier 10 液相分析系统，色谱柱为 SOURCE5 RPC ST4.6/150柱。流动相A 为V(三氟乙酸) :V(乙腈) :V(水) =0.065 : 2﹕97.935，流动相B 为V(三氟乙酸) :V(乙腈) :V(水) = 0.05 : 80 : 19.95。梯度洗脱，49.86 min内流动相A 由100%到0。检测波长215 nm，流速1 mL/min。本团队前期研究已明确，保留时间在20～25 min 的物质为泛革素[13]，因此，本研究将20～25 min 期间洗脱液的峰面积除以对应处理的芽孢浓度作为不同培养基发酵液中泛革素的浓度。

2 结果与讨论

2.1 最适基础培养基

利用8 种芽孢杆菌常用培养基对HMB19198菌株进行振荡培养，测定不同培养基中HMB19198菌株的芽孢浓度。结果表明：2 号培养基中发酵液的芽孢浓度最高，达到3.34 × 109个/mL；其次是5 号培养基，芽孢浓度为2.97 × 109个/mL，1 号和6 号培养基结果与5 号培养基接近，分别为2.90 ×109和2.83 × 109个/mL；4 号培养基中发酵液的芽孢浓度最低，仅为9.00 × 108个/mL (图1)。由于2 号培养基中的芽孢浓度最高，并且其组分简单、原料来源丰富、价格低廉且取材方便，因此，确定选择2 号培养基作为基础培养基进行进一步优化。

图1 不同基础培养基对枯草芽孢杆菌HMB19198菌株芽孢浓度的影响Fig. 1 Effect of different basic mediums on the spore concentration of B. subtilis strain HMB19198

2.2 最适宜芽孢形成的碳源及氮源确定

比较了12 种碳源对HMB19198 菌株芽孢浓度的影响。结果 (图2A) 表明：在以复杂碳源为唯一碳源的培养基中，HMB19198 菌株发酵液的芽孢浓度较高，其中以可溶性玉米淀粉作为唯一碳源时芽孢浓度最高，达到4.52 × 109个/mL；其次是以糖蜜为唯一碳源的培养基，芽孢浓度为3.38 ×109个/mL；以麦麸粉、玉米粉和水解玉米粉为唯一碳源时，芽孢浓度分别为2.14 × 109、2.05 × 109和1.93 × 109个/mL。而在以糖类物质为唯一碳源的培养基中，HMB19198 菌株发酵液的芽孢浓度较低。由于芽孢杆菌摄取糖蜜的速度较快，可作为发酵前期的速效碳源，摄取玉米淀粉的速度较慢，将其作为发酵中后期的迟效碳源，两者结合构成最适碳源组合。

图2 不同碳源 (A) 和氮源 (B) 对枯草芽孢杆菌HMB19198 菌株芽孢形成的影响Fig. 2 Spore concentrations of B. subtilis strain HMB19198 in basic medium supplemented with different carbon (A) and nitrogen (B) sources

在确定了以可溶性玉米淀粉和糖蜜为最适碳源的基础上，进一步针对10 种氮源物质进行了优化。结果 (图2B) 表明：在以花生饼浸粉为氮源的培养基中，HMB19198 菌株发酵液的芽孢浓度最高，为5.22 × 109个/mL；其次是蛋白胨和牛肉浸膏，芽孢浓度分别为3.03 × 109和3.88 × 109个/mL；而以无机氮源 (NH4)2SO4为氮源的培养基中芽孢浓度最低，仅为2.90 × 108个/mL。虽然以牛肉浸膏和蛋白胨作为氮源时芽孢浓度相近，但牛肉浸膏成本较高，故选取芽孢杆菌摄取速度较快的蛋白胨作为发酵前期的速效氮源，以花生饼浸粉作为发酵中后期的迟效氮源，两者结合构成最适氮源组合。

2.3 基础培养基中影响芽孢形成的主要因子

分别以可溶性玉米淀粉和糖蜜为碳源，以花生饼浸粉和蛋白胨为氮源，无机盐为K2HPO4•3H2O和MgSO4•7H2O，利用Plackett-Burman 法对6 个因素 (表4) 进行优化。结果 (表5) 表明：可溶性玉米淀粉、花生饼浸粉、糖蜜、K2HPO4•3H2O对HMB19198 菌株芽孢形成影响显著，是影响发酵液中芽孢浓度的主要因子。图4 中各因子的模型预测结果显示，可溶性玉米淀粉和K2HPO4•3H2O浓度与芽孢浓度呈正相关，糖蜜和花生饼浸粉浓度与芽孢浓度呈负相关。

图4 影响芽孢形成主要因子的预测模型Fig. 4 Predictive models of the main factors affecting spore formation

表4 Plackett-Burman 试验设计与芽孢浓度响应Table 4 Experimental designs of Plackett-Burman and corresponding spore concentrations

2.4 培养基中主要影响因子的最佳浓度及验证

以Plackett-Burman 分析所得4 种主要影响因子为基础，以可溶性玉米淀粉45 g/L、糖蜜10 g/L、花生饼浸粉30 g/L 及K2HPO4•3H2O 7.5 g/L 作为中心点，进行响应曲面分析，试验设计及结果见表5。

表5 Plackett-Burman 试验统计分析Table 5 The regression analysises of Plackett-Burman experiments

利用Design Expert 10 软件设计响应曲面试验（表6），对数据分析并绘制响应曲面图和等高线图 (图5) ，回归分析结果见表7。统计结果显示，A (可溶性玉米淀粉)、A × C (可溶性玉米淀粉和花生饼浸粉交互) 和B × C (糖蜜和花生饼浸粉交互)对发酵液中芽孢浓度影响影响显著。

表6 响应曲面分析试验设计及结果Table 6 Experimental designs and results of RSA

当确定糖蜜14.1 g/L、K2HPO4•3H2O 9.2 g/L为最佳值时，分析了可溶性玉米淀粉和花生饼浸粉的最佳比例。由图5a 可见：在可溶性玉米淀粉为低水平时，随着花生饼浸粉质量浓度升高，发酵液中芽孢浓度逐渐降低；在可溶性玉米淀粉为高水平时，随着花生饼浸粉质量浓度升高，芽孢浓度呈先升高后降低趋势。在花生饼浸粉为低水平时，随着可溶性玉米淀粉浓度升高，发酵液中芽孢浓度变化较小；在花生饼浸粉为高水平时，随着可溶性玉米淀粉浓度升高，芽孢浓度也逐渐升高。据此，确定两者最佳配比为可溶性玉米淀粉67 g/L，花生饼浸粉41.6 g/L。图5b 显示，可溶性玉米淀粉与花生饼浸粉两个因素的交互作用显著。

图5 可溶性玉米淀粉与花生饼浸粉双因素最适浓度及配比模拟结果Fig. 5 Simulation results of the optimum concentrations and ratios of soluble corn starch and peanut cake powder

当确定可溶性玉米淀粉67 g/L、K2HPO4•3H2O 9.2 g/L 为最佳值时，分析了糖蜜和花生饼浸粉的最佳比例。由图6a 可见：在糖蜜为低水平时，随着花生饼浸粉质量浓度升高，发酵液中芽孢浓度逐渐降低；在糖蜜为高水平时，随着花生饼浸粉质量浓度升高，发酵液中芽孢浓度呈先升高后降低趋势。而无论花生饼浸粉为高水平或低水平，随着糖蜜浓度升高，发酵液中芽孢浓度均呈先升高后降低趋势。综上，确定两者的最佳配比为糖蜜14.1 g/L，花生饼浸粉41.6 g/L。图6b 显示，糖蜜和花生饼浸粉两个因素的交互作用显著。

图6 糖蜜与花生饼浸粉双因素最适浓度及配比模拟结果Fig. 6 Simulation results of the optimum concentrations and ratios of molasses and peanut cake powder

图5 和图6 的响应面均为开口向下的凸型曲面，代表响应值存在极高值。利用Design Expert 10 软件对表7 进行进一步分析计算，得到模型预测的最佳点：即当可溶性玉米淀粉质量浓度为67.0 g/L、糖蜜为14.1 g/L、花生饼浸粉为41.6 g/L、K2HPO4•3H2O 为 9.2 g/L 时，预测HMB19198 菌株发酵液中芽孢浓度最高，为7.83 × 109个/mL。

表7 响应曲面试验回归分析结果Table 7 The regression analysis of RSA

2.5 模型验证

按照响应曲面模型预测所得最佳组合，即可溶性玉米淀粉67.0 g/L、糖蜜14.1 g/L、花生饼浸粉41.6 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO4•3H2O 9.2 g/L及MgSO4•7H2O 1.5 g/L，配制得到优化培养基，将HMB19198 菌株在优化后的培养基中振荡培养并统计芽孢浓度。结果表明，培养24 h 后，HMB19198菌株发酵液中芽孢浓度为6.92 × 109个/mL，与预测值7.83 × 109个/mL 比较接近，表明模型预测结果准确。

2.6 菌株生长曲线

HMB19198 菌株在优化培养基中培养6 h 后进入对数生长期，16 h 开始生长趋缓，20 h 时芽孢浓度达到最大值1.10 × 1010个/mL；该菌株在基础培养基中培养12 h 进入对数生长期，26 h 时芽孢浓度达到最大值7.08 × 109个/mL (图7)。研究表明，与基础培养基相比，在优化后培养基中，HMB19198菌株发酵周期可缩短40%，芽孢浓度提高了54.8%。

图7 枯草芽孢杆菌HMB19198 菌株的生长曲线Fig. 7 Growth curve of B. subtilis strain HMB19198

2.7 优化培养基中发酵液产生的泛革素浓度

HMB19198 菌株分别在优化培养基和基础培养基中振荡培养后，提取2 种培养基中的脂肽类抗生素粗提液，利用HPLC 进行分析。结果表明，与基础培养基相比，优化后培养基中泛革素的产量提高了39.4% (表8) 。

表8 培养基优化前后发酵液中泛革素浓度Table 8 Relative contents of fengycin in fermentation mediums before and after optimization

3 结论与讨论

芽孢是芽孢杆菌产生的休眠体，含水量极低，抗逆性强，能耐受高温、紫外线等。以芽孢为主要成分的微生物农药制剂货架期较长，是开发微生物源杀菌剂的主要成分[20]。

碳源物质是培养基中的重要组分之一，负责为细胞提供能源、构成碳架及合成代谢产物[21]。常见碳源物质主要包括碳水化合物、脂肪、有机酸等。以生产芽孢为目的的芽孢杆菌发酵培养基通常以廉价且易获取的农副产品及各种糖类为碳源，如玉米粉、淀粉、糖蜜、麸皮及蔗糖等[22-23]。本研究通过对不同碳源物质进行优化，发现以可溶性玉米淀粉为碳源能提高HMB19198 菌株发酵液的芽孢浓度。可溶性玉米淀粉是植物多糖类碳源，在细菌发酵过程中可被降解为葡萄糖，进而被细胞吸收和转化。葡萄糖是细菌优先利用的碳源，但过量的葡萄糖也会抑制细菌的生长和代谢代谢[24-25]。由于淀粉降解为葡萄糖存在一个缓慢的过程，保证了培养基中葡萄糖不会大量积累，因而避免了过量葡萄糖所造成的负面效应[26]。尹凤娇等[27]通过单因素试验，筛选出了最适合解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciensY4 菌株芽孢形成的碳源为可溶性淀粉，并通过Plackett-Burman 分析，明确了可溶性淀粉是影响发酵液中芽孢浓度的主要因子。糖蜜是食糖加工过程的副产品，含有较高浓度的蔗糖，易被细胞吸收。本研究发现，糖蜜也能提高HMB19198 菌株发酵液的芽孢浓度，但糖蜜的浓度与芽孢形成率呈负相关，说明高浓度的糖蜜会抑制HMB19198 菌株芽孢的形成，因此，糖蜜可作为芽孢杆菌发酵前期的能量来源。

氮源物质的主要功能是构成细胞结构 (氨基酸、蛋白质、核酸等) 及合成含氮代谢产物。根据被微生物利用的速度，氮源物质可分为迟效氮源(黄豆粉、花生饼浸粉、棉籽饼粉等) 和速效氮源(蛋白胨、硫酸铵等) 。迟效氮源通常为蛋白质含量较高的农副产品，其中花生饼浸粉含氮量为8.0%，高于豆饼粉 (6.71%) 、棉籽饼粉 (6.56%) 和黄豆粉 (5.2%)[28]。本研究发现，以花生饼浸粉为氮源能显著提高HMB19198 菌株的芽孢形成率。原因可能除花生饼浸粉蛋白质含量较高外，还因其含有较多的氨基酸、多肽及某些生长因子，能促进HMB19198 菌株的生长和代谢。

碳/氮比 (C/N ratio) 是微生物发酵培养基的重要参数，直接影响发酵过程中菌体的生长和代谢，碳/氮比过高或过低均不利于芽孢杆菌的发酵[29]。适合芽孢杆菌发酵的培养基碳/氮比通常为5～10；碳/氮比偏高 (12～20) 通常会导致芽孢产量降低，但可刺激代谢产物的分泌；而碳/氮比过高(> 20) 会导致芽孢及代谢产物产量同时降低；碳/氮比过低 (< 5) 则会导致菌体自溶[30]。本研究通过响应曲面法，分析了可溶性玉米淀粉和糖蜜组成的碳源与不同比例花生饼浸粉氮源对HMB19198菌株芽孢形成的影响。结果发现，可溶性玉米淀粉和糖蜜浓度处于较高水平、花生饼浸粉浓度在中等水平，即碳/氮比为15.8 时，发酵液中芽孢浓度最高。本研究优化后培养基的碳/氮比略高于上述碳/氮比最适区间 (5～10) ，其原因可能是由于芽胞杆菌发酵的最适碳/氮比还受其他因素影响。不同碳源与氮源组合的最适碳/氮比通常不同[31]，另外，不同菌种对碳/氮比的偏好也不同。相较于芽孢杆菌，假单胞菌的碳/氮比最适区间为7～14；酵母菌在碳/氮比为4 时菌体生长旺盛，而在碳/氮比为3 时，可代谢产生较多的谷氨酸[31]。Jin 等[15]发现，用菜籽粕代替蛋白胨作为氮源，在相同碳源情况下可使枯草芽孢杆菌 3-10 菌株的发酵水平提高20%，并使脂肽类抗生素伊枯草菌素 (iturins)的产量提高了8 倍。除此之外，碳/氮比对芽孢产量的影响也会随氧传递系数的增大而逐渐降低。培养基中固体含量较多或质地较粘稠都会导致氧传递系数降低，通气性变差，此时就需要较高的碳/氮比以维持细菌旺盛的生长[32]。

培养基中的矿物质元素虽然不参与细胞物质的组成，但却是很多酶的辅助因子。钾离子与细胞渗透压和透性相关，在培养基中可起到一定的缓冲剂作用并维持pH 值稳定。本研究发现，K2HPO4•3H2O 浓度与HMB19198 菌株的芽孢浓度呈正相关，且9.2 g/L 的K2HPO4•3H2O 最适合HMB19198 菌株芽孢的形成。不同菌株对钾离子浓度的需求可能不同。林陈强等[33]的研究表明，培养基中添加适量的钾离子能促进地衣芽孢杆菌CHB6 菌株的生长和芽孢形成，优化后的培养基中芽孢浓度可达到4.8 × 109个/mL，芽孢形成率为90.6%。张丽霞[34]通过分析K、Mg、Mn、Fe、Zn、Cu、Mo 及Ca 等矿物质养料对芽孢杆菌生长的影响，确定了K 对枯草芽孢杆菌发酵液芽孢浓度影响最大，进一步明确了K2HPO4是最佳的K供体，在K 质量浓度为0.7 g/L 时，发酵液中芽孢浓度最高，较优化前提高了29%。K2HPO4在提供K 的同时还可以提供P 元素，P 是核酸和蛋白质的必要成分，也是细胞膜的重要组分[21]，同时P 还是微生物平衡生长的限制因素。

泛革素是枯草芽孢杆菌及其近源种产生的一种脂肽类抗生素，在抑制病原菌生长和防治作物病害中发挥着重要作用[35-36]。本团队前期研究[13]证明，泛革素是HMB19198 菌株产生的主要抑菌活性物质，在抑制番茄灰霉病菌生长和防治番茄灰霉病中具有重要作用。因此，提高发酵液中泛革素的含量能提高HMB19198 菌株的防病效果。Yassen 等[7]的研究表明，发酵液中泛革素含量受培养基中碳源和氮源影响较大。Islam 等[6]比较了枯草芽孢杆菌C9 菌株在不同碳、氮源组合下的泛革素产量，发现以甘露醇为碳源、以黄豆粉为氮源能提高泛革素的产量。因此，通过发酵培养基优化提高泛革素产量是一种有效途径。本研究筛选得到了利于HMB19198 菌株芽孢形成的优化培养基，发现在优化培养基中，HMB19198 菌株的泛革素产量提高了39.4%。芽孢杆菌中脂肽类抗生素的产生一般发生在对数生长后期至芽孢形成前期，一些基因同时调控着芽孢的形成和脂肽类抗生素的产生，因此，提高芽孢的形成率往往伴随着脂肽类抗生素产量的提高[37]。本研究也发现，采用优化后的培养基不仅提高了HMB19198 菌株发酵液中芽孢浓度，同时还提高了泛革素的产量。