含锌复绿剂在小竹笋复绿护绿工艺中的应用

章金梅，唐云，伊奎鑫，刘仁杰

浙江耕盛堂生态农业有限公司（湖州 313000）

植物的绿色主要来源于叶绿素，叶绿素是植物进行光合作用产生的一种脂溶性色素，其分子是由2个部分组成的，即1个核心部分卟啉环和1条很长的脂肪烃侧链，称为叶绿素醇（phytol）。叶绿素分子的卟啉环含有4个吡咯环，通过4个甲烯基链接而成。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相连的氮原子则偏向于带负电荷，因而卟啉环具有极性和亲水性，可以与蛋白质结合[1]。植物的叶绿素与脂蛋白结合，脂蛋白可以保护叶绿素免受植物组织内存在的有机酸作用，使其性质稳定[2]。

叶绿素的化学性质很不稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，分解速度更快[1]。叶绿素降解主要有以下两种途径：一是由于光照、氧气、pH、金属离子导致的叶绿素内卟啉环的中心镁离子被氢离子取代，形成黄褐色的脱镁叶绿素，进而脱甲酯基形成焦脱镁叶绿素，使其结构发生改变[3]；二是酶促反应、脂质氧化导致的叶绿素降解，酶促降解途径主要由叶绿体中过氧化物酶-H2O2酶促降解系统和胞质中的抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统组成，这2种降解系统与活性氧含量相关[4-6]。有资料显示，在酸性环境下，叶绿素分子中的镁离子会被氢离子取代，从而产生暗绿色至绿褐色的脱镁叶绿素，但叶绿素在碱性条件下可水解为叶绿酸（盐）、叶绿醇及甲醇，如果镁离子被铜、锌离子取代，则色泽亮绿，这是加工蔬菜保绿的理论依据[7]。铜的活性比锌高，所以在取代速度上，铜要比锌快些[2]。多种绿色蔬菜的护绿已有较多研究：王珏琪等[8-9]在蕨菜复绿和护绿过程中对含铜和含锌复绿剂进行应用和研究；刘学勤等[10]在研究沙芥腌制过程护绿发现，漂烫温度75～80 ℃、硫酸铜700 mg/kg+葡萄糖酸锌500 mg/kg、漂烫2 min对沙芥的护绿效果最好；在以海带为原料的研究中，康三江等[11-12]对野生苣荬菜护绿过程中叶绿素保留率进行多因素试验，其最佳护绿工艺条件为护色液pH8、烫漂时间60 s、植酸钠质量浓度0.1 g/L。国外对于护绿的过程也都是选用金属离子取代叶绿素中的镁离子进行的[13-16]，选择合适的烫漂时间及温度是绿色蔬菜的品质得以保护和长期存放[17]的基本条件。所以，在现行的绿色蔬菜护绿加工过程中，烫漂工艺常与金属离子取代法相结合[18]。

竹笋作为一种绿色森林蔬菜，富含蛋白质、膳食纤维、氨基酸、矿物质、无机盐等多种营养成分[6]，受到消费者欢迎。鲜竹笋贮藏时间短，故常被加工成笋干、水煮笋罐头、腌制笋等食品。竹笋在腌制或热加工过程中，叶绿素容易被氧化和变色，因此传统的加工方式难以维持小竹笋原本的绿色，市面上大多数的绿竹笋，有使用叶绿素铜钠盐染色，也有使用日本进口复绿剂复绿，前者染色效果不好，容易造成笋肉染成绿色，后者只适合在腌制品中使用，成本较高。含锌复绿剂的复绿效果虽然没含铜复绿剂好，但锌的安全性较铜要高，锌可作为营养强化剂使用，是人体不可缺少的元素，但是过多也会对人体的健康造成不良影响。通过小竹笋复绿前后色差颜色的比较，并用火焰原子吸收分光光度计对终产品锌元素含量进行测定，探索醋酸溶液对产品中锌含量的影响，从而确定含锌复绿的最优条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原辅料

新鲜绿色小竹笋（采摘时间3—4月，原料产地安徽滁州，选择组织脆嫩、粗壮、无虫害、无腐败变质的小竹笋）；去壳后表皮为绿色的竹笋（广德向阳生态食品有限公司）；腌制小竹笋（将去壳新鲜小笋清洗，加盐漂烫后，腌制，加盐量16%）。

1.1.2 试剂

食品级片碱；D-异抗坏血酸钠；柠檬酸锌；冰醋酸（杭州胜东贸易有限公司）；锌标准储备溶液（基准试剂，质量浓度1 000 mg/L）。

1.2 仪器与设备

测色色差仪（WSC-S，上海笛柏实验设备有限公司）；原子吸收分光光度计（岛津AA-6300C，日本岛津制作所）；微波消解仪[MD8H，奥普乐科技集团（成都）有限公司]；石墨消解仪[GD-25，奥普乐科技集团（成都）有限公司]；雷磁（PHS-3E，上海仪器科学仪器股份有限公司）；电子天平[BSA124S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 试验工艺流程

通过前期预试验比较，确定最优的生产工艺流程和复绿剂。

腌制小竹笋复绿：腌制原料清洗脱盐→用柠檬酸锌溶液浸泡过夜→在偏碱性溶液中预煮→冷却→包装加入D-异抗坏血酸钠溶液→高温杀菌→储存。

新鲜小竹笋护绿：新鲜原料加盐热烫→换水在偏碱性的柠檬酸锌溶液中预煮→冷却→包装加入D-异抗坏血酸钠溶液→高温杀菌→储存。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 原料前处理

将腌制好的小竹笋，清洗脱盐，挑选出虫笋、伤笋，修去基部粗老部分，备用。

1.3.2.2 复绿过程

每组试验取100 g清洗后小笋，柠檬酸锌复绿液按照各因素水平配制500 mL。设定不同漂烫温度（T）、复绿液质量浓度（N）、预煮液pH的因素水平，初期试验筛选出漂烫时间20 min时复绿效果最佳。柠檬酸锌复绿液质量浓度0.3 g/L、漂烫温度80 ℃时，预煮液pH分别为6，7，8，9和10；柠檬酸锌复绿液质量浓度0.3 g/L、预煮液pH 8时，漂烫温度分别为60，70，80，90和100 ℃；漂烫温度80 ℃、预煮液pH 8时，柠檬酸锌复绿液质量浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g/L，单因素试验结束后，取各因素最优3组条件进行L9(33)正交试验，每组试验参数平行2次。通过色差仪对设定试验的结果进行颜色测定，并用火焰原子吸收分光光度计测定锌元素含量。根据筛选出的最优试验浓度、pH和漂烫温度对新鲜小竹笋的护绿效果进行验证，同时验证1.5 g/L醋酸溶液浸泡可降低复绿小笋中锌含量的结论[17]。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 色泽测定

将每组样品试验后的样品用清水冷却，添加一定浓度的D-异坏血酸钠，真空包装成固形物80%的成品，高温杀菌（117 ℃，35 min），冷却后开袋用色差仪[19-20]直接检测，每个样品选取部位相同，平行测定2次，取平均值作为单个样品的测定结果。仪器显示参考量设定为Lr*=91.24，ar*=-0.87，br*=3.90，根据测得的明度、偏红绿程度和偏黄蓝程度作为筛选依据，进一步进行正交试验，确定最佳复绿试验条件。

1.3.3.2 锌元素含量测定[21]

锌元素火焰原子吸收光谱法仪器工作条件：波长213.9 nm，狭缝0.2 nm，灯电流3～5 mA。燃烧头高度3 mm，空气流量9L/min，乙炔流量2L/min。

锌标准曲线制作：取1.00 mL购置的锌标准储备液（1000 mg/L）于容量瓶中，加硝酸溶液（5+95，体积比）至刻度，混匀。分别准确吸取2.00，4.00，6.00，8.00和10.00 mL于100 mL容量瓶中，加硝酸溶液（5+95，体积比）至刻度，混匀。此锌标准系列溶液的质量浓度分别为0.200，0.400，0.600，0.800和1.000 mg/L。将锌标准系列溶液按照质量浓度由低到高的顺序分别导入火焰原子化器，原子化后测其吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，见图1。

图1 锌离子浓度标准曲线

样品处理：准确称取0.5 g（精确至0.001 g）试样于微波消解罐中，加入6 mL硝酸消解。冷却后取出消解罐，在石墨消解仪上赶酸至1 mL左右，待消解罐放冷后，将消化液转移至100 mL容量瓶，并用少量水洗涤消解罐2～3次，合并洗涤液于容量瓶中，用水定容至刻度，混匀备用。每组样品平行2次，取平均值，同时做试剂空白试验。

2 结果和分析

2.1 单因素试验复绿后色泽的测定结果与分析

色差仪检测结果中，L*代表试样明度（0为黑，100为白），a*正数代表试样偏红，a*负数代表试样偏绿，b*正数代表试样偏黄，b*负数代表试样偏蓝。因绿竹笋呈绿色或黄绿色，对亮度的干扰较大，所以L*值不精确，试验只考虑a*和b*值。

2.1.1 不同pH预煮液试验结果

从图2和图3可看出，预煮液呈弱酸性pH6时，小竹笋偏绿效果不明显，与文献报道介质H+浓度的下降有利于卟啉环中的H+被Zn2+取代一致[22]。孙鹤等[23]对绿色蔬菜汁中叶绿素的稳定性研究也表明，叶绿素在pH为中性偏微酸（碱）时最稳定。随着预煮液pH的升高，小笋偏红绿程度呈下降趋势（即偏绿结果越来越明显），偏黄蓝程度也呈下降趋势（即偏黄结果越来越不明显），且在pH7时，小笋色泽已达到要求，故选取pH7，8和9这3个水平进入正交试验。

图2 预煮液pH单因素试验偏红绿程度结果

图3 预煮液pH单因素试验偏黄蓝程度结果

2.1.2 不同预煮温度试验结果

从图4和图5可见，预煮液pH8、柠檬酸锌溶液质量浓度0.3 g/L时，随着预煮液温度升高，小笋偏红绿和偏黄蓝程度呈现先下降后上升趋势，且在预煮液温度为80 ℃时，小笋的绿色达到最大值，复绿效果最佳，预煮液温度70 ℃时，小笋色泽达到要求，故选择70，80和90 ℃这3个水平进入正交试验。

图4 温度单因素试验偏红绿程度结果

图5 温度单因素试验偏黄蓝程度结果

2.1.3 不同柠檬酸锌浓度试验结果

由图6和图7可知，在预煮液pH8、预煮温度80 ℃条件下，随着复绿剂浓度增加，小笋偏红绿程度呈现下降趋势（即偏绿结果越来越明显），偏黄蓝结果也呈现下降趋势（即偏黄结果越来越不明显），且柠檬酸锌质量浓度达到0.2 g/L时，小笋的色泽达到要求，故选择柠檬酸锌质量浓度为0.2，0.3和0.4 g/L这3个水平进入正交试验。

图6 柠檬酸锌单因素试验偏红绿结果

图7 柠檬酸锌单因素试验偏黄蓝结果

2.2 正交试验色泽测定结果与分析

通过小笋各组复绿的单因素试验结果，进入正交试验，结果如表1和表2所示。

表1 小笋正交试验偏红绿程度结果

表2 小笋正交试验偏黄蓝程度结果

试验结果中，在偏红绿和偏黄蓝程度值中，试验组第5组结果最好，正交试验对于小笋复绿条件最优组合为正交试验第5组A2B2C3，但a*值和b*值的K值检验均显示漂烫pH条件对于复绿效果的影响更显著，K值检验后最优为A2B3C3，以A2B3C3为试验条件再次进行试验，结果为a*=-20.32±0.68，b*=66.78±1.32，均不如正交试验最优组，所以经过试验及验证可得，小笋复绿最优工艺为漂烫温度80 ℃、漂烫液pH 8、复绿剂质量浓度0.4 g/L。

2.3 锌元素含量测定结果与分析

虽然根据试验结果得出复绿过程最优组合，但试验旨在通过复绿后锌元素含量进一步确定复绿剂复绿过程最优组合。正交试验中各试验组锌含量见表3。

2011年《食品中锌限量卫生标准》废止，且现行国家标准中未对竹笋中锌含量作出明确规定，GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中也未把锌作为污染物指标[24]，参考LY/T 1673—2006《山野菜》中对锌的规定为≤50 mg/kg，建议竹笋罐头中锌含量控制在50 mg/kg以内。由表3可知，所有试验组的锌含量结果均在50 mg/kg以内。

表3 各试验组锌元素含量测定结果

2.4 用1.5 g/L醋酸溶液浸泡对比结果

对醋酸溶液浸泡可降低锌含量的验证，选用预煮液pH8、预煮温度80 ℃、柠檬酸锌0.4 g/L，用1.5 g/L的醋酸溶液浸泡和清水浸泡对照，检测锌含量的结果见表4。

表4 不同浸泡液处理后样品中的锌含量

由表4可知，复绿后用1.5 g/L醋酸溶液浸泡后包装杀菌，在同等条件下，锌含量较清水浸泡降低42.4%。可在确保复绿的情况下，用醋酸溶液浸泡复绿后的小笋可降低锌含量。

2.5 新鲜小竹笋复绿效果验证

用上述试验得到的影响因子对新鲜小竹笋护绿进行验证，用3%盐水溶液预煮5 min，冷却后用pH 8，0.4 g/L的柠檬酸锌溶液恒温至80 ℃，预煮20 min，冷却后包装，加入D-抗坏血酸钠溶液，高温117 ℃，杀菌35 min，可保持竹笋的绿色，a*=-20.33±0.54，b*=62.20±1.08。添加D-抗坏血酸钠溶液的样品较不添加的样品，绿色保持更持久。

3 讨论与结论

小竹笋护绿复绿原理都是叶绿素中的镁原子被稳定性更好的锌原子所取代，由于叶绿素镁的不稳定性，在光照、高温、腌渍过程中都容易被氢离子取代，在处理新鲜小笋时，先用加盐漂烫方式将镁离子游离出来，再用含锌的化合物提供锌离子与脱镁叶绿素结合是可行的。

在小笋复绿过程中，不应单纯依靠复绿后色泽变化的最佳值来判定复绿剂的最佳浓度，应结合小笋本身的颜色、腌制过程中的氧化程度，以及产品最终的锌含量来确定工艺的最优组合。试验主要以腌制小笋为原料探索柠檬酸锌在小笋复绿过程中的可行性工艺及最优工艺参数，新鲜小笋仅进行工艺上的验证，后期对于新鲜小笋的研究更具生产价值，不仅可降低生产成本，而且可减少腌制废水的排放。

试验证明，叶绿素锌的稳定性优于叶绿素镁，在117 ℃高温杀菌后，仍能保持绿色，经过后期试验添加D-抗坏血酸钠的竹笋罐头，叶绿素的稳定性更好，透明包装袋在自然光照的情况下，能保持6个月不变色。复绿剂选用柠檬酸锌时，腌制小竹笋复绿的最优工艺参数为柠檬酸锌质量浓度0.4 g/L，预煮液pH 8，预煮温度80 ℃。在此条件下，能生产出绿色、锌含量＜50 mg/kg的小竹笋罐头。