高效液相色谱法测定天然本草类牙膏中黄芩苷含量

陈杰锋 高 艳

(无限极(中国)有限公司，广东广州510000)

引言

中草药牙膏是我国口腔清洁护理用品行业的特色，开发中草药牙膏是促进中医药传承创新发展的具体体现之一。中药黄芩为草本植物黄芩根的提取物，在中药学中，被认为味苦、性寒，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，在口腔护理用品的应用历史由来已久。现代药理研究表明中药黄芩提取物的主要成分为黄酮类分子，其中较高的是黄芩素和黄芩甙[1]。黄芩苷具有降压、镇静、保肝、抗菌、消炎等多种药理作用[2]。《中国药典》记载黄芩苷是黄芩药材的活性成分之一，且对药材中黄芩苷的含量有要求。研究了牙膏中黄芩苷含量的测定方法，用于去判断牙膏中加了黄芩提取物以及其在牙膏产品中稳定性。

1 实验和方法

1.1 仪器与材料

①Agilent 1200Series高效液相色谱仪系统(G1329A ALS，G1311A Quat Pump，G1322A Degasser，G1316A TCC，G1315D DAD)；

②梅特勒-托利多XSE205型电子天平(感量0.01mg)；

③梅特勒-托利多ML204T型电子天平(感量0.1mg)；

④昆山市超声仪器有限公司KQ-400DE型数控超声波清洗器；

⑤Thermo Fisher Sorvall ST 16R离心机；

⑥IKA MS3涡旋振荡器；

⑦黄芩苷标准品(中国食品药品检定研究所，含量以95.4%计)；

⑧植雅牙膏(规格：140克/支，无限极(中国)有限公司生产)；

⑨乙腈(色谱纯，默克股份两合公司)；

⑩无水乙醇(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；

1.2 色谱条件

①色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)；

②流动相：A相(乙腈)，B相(0.1%磷酸溶液)，梯度洗脱，见表1；

表1 流动相梯度洗脱表

③流量：1.0mL/min；

④柱温：30℃；

⑤进样量：10μL；

⑥检测波长：277nm。

1.3 标准品溶液的制备

黄芩苷标准储备溶液：精密称取黄芩苷标准品50mg(精确至0.01mg)至250mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成200μg/mL标准储备溶液。

1.4 供试品溶液的制备

称取试样1g(精确至0.1mg)于50ml具塞刻度离心管中，加入约1g石英砂，再准确加入乙醇-磷酸混合溶液(无水乙醇+磷酸+水=50+6+44，体积比)20mL，称定质量，涡旋振荡2min，25℃水浴中超声提取40min，冷却至室温后用乙醇-磷酸混合溶液补足损失质量，5000r/min离心分离10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液作为试样溶液上机待测。

1.5 测定和计算

按上述条件测定标准工作溶液和待测溶液，根据色谱峰的保留时间和紫外光谱图定性，根据标准工作溶液浓度和色谱峰面积回归直线方程定量，按公式(1)计算样品中黄芩苷的含量。

(1)

式中：X——试样中黄芩苷的含量，mg/kg；

C——从标准曲线中得出的黄芩苷浓度，μg/mL；

V——试样溶液的体积，mL；

m——试样质量，g。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的确定

2.1.1 根据黄芩苷的结构以及理化性质，对提取溶剂和提取方法进行考察，筛选合理的提取方法。考虑到牙膏试样在水中分散效果较好，本次实验采用有机溶剂-水体系作为提取溶剂。考察了不同比例的甲醇水溶液和乙醇水溶液(30%，50%，70%，90%，100%)对含有黄芩苷的牙膏试样的提取效果，结果见图1。当有机溶剂比例从30%增大到50%时，甲醇-水和乙醇-水作为提取溶剂，均测得试样中黄芩苷的含量逐渐增多，在比例在50%时，测得含量最大值。有机溶剂比例超过50%后，继续增大其比例，黄芩苷的含量逐渐减少。综合两个溶剂体系对黄芩苷的提取情况，使用50%乙醇水溶液测得的黄芩苷含量最高。同时，考虑到牙膏一般具有较好的水分散性，提取溶剂中有机溶剂的比例越高，牙膏在提取溶剂中的分散效果越差。因此选择50%乙醇水作为黄芩苷的提取溶剂。另外，为了提高牙膏在提取溶剂中的分散效果，本次实验选择加入适量石英砂对牙膏试样进行辅助分散。

图1 不同比例有机溶剂水溶液的提取效果对比

2.1.2 提取溶剂中磷酸浓度的选择

黄芩苷在酸性条件下的化学性质更稳定[3]，在提取溶剂中添加一定浓度的磷酸可使碳酸钙基质牙膏溶解更充分，提高黄芩苷的提取效率。本次实验考察了在溶剂中添加不同浓度的磷酸(0%，0.5%，1%，2%，4%，6%，8%，10%)(体积分数)对含有黄芩苷的牙膏试样的提取效果影响，结果见图2。随提取溶剂中磷酸浓度逐渐增大，测得试样中黄芩苷含量逐渐增多，其中提取溶剂中添加磷酸浓度为6%、8%、10%时，黄芩苷提取的效果明显优于其他浓度。同时测得提取溶剂中磷酸浓度为6%、8%、10%时，其pH值分别为1.41、1.24、1.11。综合考虑到提取溶剂酸性过大可能会对色谱柱的性能及使用寿命造成一定影响，且提取溶剂中磷酸浓度为6%、8%、10%时，提取效果差异较小，因此选择在提取溶剂添加磷酸的浓度为6%，即乙醇-磷酸-水溶液(50+6+44)(体积比)作为本方法的提取溶剂。

图2 提取溶剂中不同磷酸浓度的提取效果对比

2.2 仪器色谱条件的确定

2.2.1 检测波长的选择

通过使用二极管阵列检测器(DAD)对黄芩苷标准品溶液在190-400nm波长范围内进行扫描，结果显示(见图3)，黄芩苷在紫外光214nm，277nm，316nm波长处均有特征收。由于214nm波长处容易受到流动相的影响，316nm波长处吸光度值较小，皆不适合作为检测波长，综合考虑，本方法选择277nm作为检测波长。

图3 黄芩苷标准溶液的紫外吸收光谱图

2.2.2 色谱柱的选择

本次实验考察了Agilent Eclipse Plus C18、Agilent ZORBAX SB-Aq、Waters Xbridge C18和Agilent TC-C18(2)等不同型号相同规格(250mm×4.6mm，5μm)的C18色谱柱对黄芩苷和试样基质的分离效果。结果显示，在优化的流动相条件下各种C18色谱柱能实现黄芩苷和试样基质的有效分离，尤其使用Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱时，峰形尖锐对称。综合考虑，最终选择使用C18色谱柱作为分离色谱柱。

2.2.3 流动相的选择

本次实验比较了甲醇-水溶液及乙腈-水溶液两种流动相体系对黄芩苷和试样基质的分离效果。结果显示，在乙腈-水溶液流动相体系下采用梯度洗脱能够实现黄芩苷和试样基质的良好分离，尤其当水相中加入0.1%浓度的磷酸时，色谱峰峰形对称、响应值较高。因此，本方法采用乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

2.3 线性范围与检出限

分别精密量取1.3步骤中黄芩苷标准储备溶液0.25mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、25.0mL置于50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，分别配制成浓度为1.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、100.0μg/mL的标准溶液系列，依前述色谱条件进行测定。记录色谱峰峰面积，以标准工作溶液浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得出黄芩苷的回归方程为：

y=27.6365x-2.3628

R2=0.9999

由以上回归方程可知黄芩苷在1.0μg/mL～100.0μg/mL之间呈良好线性关系。

取牙膏试样按1.4步骤制备待测溶液，通过将该测试溶液逐级稀释并上机测试，测定目标物的信噪比(S/N)，将所得信噪比大于3时对应的稀释后浓度作为方法的检出浓度，结果显示，本方法的检出浓度为0.05μg/mL。当试样称样量为1g，溶液定容体积为20mL时，方法检出限为1mg/kg。

2.4 方法特异性

本次实验分别考察了3种基质牙膏(二氧化硅基质、碳酸钙基质和磷酸氢钙基质)阴性样品和添加黄芩苷标准品后的色谱图。结果如图4～9所示，表明三种基质中存在的物质对本方法目标检测物质没有干扰。

图4 二氧化硅基质(阴性样品)牙膏溶液谱图

图5 二氧化硅基质(阴性样品)牙膏加标溶液谱图(1：黄芩苷)

图6 碳酸钙基质(阴性样品)牙膏溶液谱图

图7 碳酸钙基质(阴性样品)牙膏加标溶液谱图(1：黄芩苷)

图8 磷酸氢钙基质(阴性样品)牙膏溶液谱图

图9 磷酸氢钙基质(阴性样品)牙膏加标溶液谱图(1：黄芩苷)

2.5 重复性试验

分别平行称取三种不同基质牙膏试样6份，依照1.4步骤制备的供试品溶液，依前述色谱条件进样测定黄芩苷含量，结果见表2。6次进样测得三种不同基质牙膏中黄芩苷含量平均值分别为799mg/kg、749mg/kg、780mg/kg，RSD分别为0.6%、2.2%、2.9%。结果表明，该方法重复性良好。

表2 三种基质试样重复性测定结果

2.6 中间精密度试验

由不同操作人员A、B，分别对同一批次牙膏试样平行称取样品6份，依照1.4步骤制备供试品溶液，依前述色谱条件进样测定黄芩苷含量，结果见表3。测得牙膏试样中黄芩苷含量平均值分别为749mg/kg和748mg/kg，RSD为1.9%。结果表明，该方法中间精密度良好。

表3 黄芩苷含量测定的中间精密度实验数据

2.7 准确度(回收率)试验

分别平行称取三种基质(二氧化硅、碳酸钙、磷酸氢钙)牙膏试样(阳性样品)各9份，每份约0.5g(称样量减半)，共三组，分别定量加入黄芩苷标准溶液，添加浓度水平为试样本底含量的50%、100%、150%，按1.4步骤处理后进行上机测定，结果见表4～6。从表中可看出，三种基质牙膏试样在不同加标浓度下的平均加标回收率为94.0%～97.9%，RSD为0.4%～2.4%。结果表明，本方法准确可靠，精密度高。

表4 二氧化硅基质牙膏试样加标回收率测定结果

表5 碳酸钙基质牙膏试样加标回收率测定结果

表6 磷酸氢钙基质牙膏试样加标回收率测定结果

2.8 稳定性试验

取牙膏试样按1.4步骤制备供试品溶液，依前述的色谱条件在0h、6h、12h、18h、24h分别进样，测定黄芩苷含量，结果见表7。牙膏试样中黄芩苷含量平均值为727mg/kg，RSD为0.9%，结果表明，在24小时内供试品溶液稳定性良好。

表7 放置时间对黄芩苷测试结果的影响

2.9 样品测试

分别取5个不同批次天然本草类牙膏试样，每批次平行取样2份，依照1.4步骤制备供试品溶液，上机进样测定黄芩苷含量，结果分别见表8。

表8 天然本草类牙膏试样中黄芩苷含量测定结果

3 讨论

本研究根据黄芩苷的结构及理化性质，对提取溶剂和提取方法进行了系统考察，并结合牙膏试样在水中分散效果较好的特点，通过实验最终选择50%乙醇-水溶液作为提取溶剂，为了提高牙膏在提取溶剂中的分散效果，实验中加入了适量石英砂对牙膏进行辅助分散。同时，考虑到黄芩苷在酸性条件下的化学性质更稳定，在提取溶剂中添加6%磷酸(体积分数)使碳酸钙基质牙膏溶解更充分，通过实验证明，能有效提升黄芩苷的提取效率。

经反复实验，最终确定使用Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱：0～2min(13%A)，2～18min(13%A->30%A)，18～25min(30%A)，25～28min(30%A->13%A)，28～30min(13%A)；流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长277nm；进样量：10μL。结果表明，此方法条件下黄芩苷色谱峰形较理想，分离效果好，黄芩苷质量浓度在1.0μg/mL～100.0μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系(R2= 0.9999)，将该方法应用于牙膏试样的测定，其方法特异性、重复性、中间精密度、准确度和稳定性良好。

本次实验针对不同基质的牙膏试样，利用高效液相色谱法(HPLC)建立了简便、灵敏、准确测定牙膏中黄芩苷的含量检测方法，可作为天然本草类牙膏中黄芩苷含量的质量控制方法，在牙膏产品安全质量和应用研究领域发挥作用，更好优化研发产品，为消费者提供值得信赖的数据支持。

参考文献(略)