肝细胞癌的细胞分裂周期基因20表达与临床病理特征关系及对预后的影响

宋应周，孟松峰

肝细胞癌在全球肝脏恶性肿瘤中发病率呈上升趋势，已成为癌症死亡的第二大诱因［1］。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒慢性感染、肝硬化、酒精性肝病和黄曲霉毒素等造成了肝细胞癌的高发病率［2-4］。然而，促进肝癌发病机制仍不清楚。在肝细胞癌发生过程中，细胞周期检查点的改变可能与癌症形成密切相关［5］。细胞分裂周期基因20（CDC20）是细胞周期检查点的调节剂，与细胞周期后期中复合物/环体相互作用的调节蛋白和有丝分裂相关［6］。CDC20可与APC结合并在有丝分裂和G1期激活细胞周期蛋白的泛素化活性，促进细胞增殖［7］。CDC20可通过调节细胞周期、促进细胞凋亡，抑制恶性转化［8］。研究表明，多种癌症中CDC20的高表达，与肿瘤的增殖、侵袭及不良预后有关［9-12］。然而，CDC20在肝细胞癌中的研究较少，该研究通过检测肝细胞癌组织中CDC20的水平，分析CDC20的表达与病人临床病理特征的关系及对预后的影响，为肝细胞癌的预后判断提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2016年5月至2017年12月在商丘市第三人民医院行手术治疗的肝细胞癌病人146例，男115例，女31例，年龄范围为38～62岁，收集病人的临床资料。收集手术切除的肝细胞癌组织及对应的癌旁组织，放置于−80℃超低温冰箱中。术后采用电话的方式定期随访，最短随访时间5个月，最长随访时间36个月，随访截止日期为2020年12月1日，146例的临床资料及随访资料完整。该研究经商丘市第三人民医院伦理委员会批准（20160412），病人或其近亲属同意并签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR） qRT-PCR检测肝细胞癌组织中CDC20mRNA的表达。组织中的总RNA根据Trizol试剂盒进行提取。提取的RNA逆转录为互补DNA（cD‐NA），进行实时荧光定量PCR。CDC20正向引物序列5′-TCGAAGTCACTCGGTAGCGT-3′，反向引物序列5′-GATCCTGCATACTGCTTGCA-3′；U6正向引物序 列5′-GGCCTCATCCTCATCATGGCAGUAG-3′，反向引物序列5′-AGCCAGATGCCTAGCGACGTGC‐GC-3′。总反应体系为20μL，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。以管家基因U6 mRNA水平作为内参照，采用2−ΔΔCt法计算CDC20 mRNA的相对表达水平。

1.2.2蛋白质印迹法 蛋白质印迹法检测肝细胞癌组织中CDC20的表达。取组织中的总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒取30μg的蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将电泳凝胶上的蛋白湿转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，PVDF膜放置含有1%BSA的盒子中，孵育2 h、之后经过一抗孵育（1∶1 000稀释，4℃过夜）、TBST洗涤3次、二抗孵育（1∶4 000稀释，室温1 h）、TBST洗涤3次后，在PVDF膜上滴加适量化学发光显色液，在凝胶成像系统中拍照，根据灰度值估测CDC20蛋白表达水平。

1.2.3免疫组织化学实验 免疫组织化学检测肝细胞癌组织中CDC20的表达。切制冷冻切片，经过脱蜡和梯度乙醇水化处理后，利用PV6000法染色，加入3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶。置于修复液中，加热行抗原进行修复，然后放置室温自然冷却。经封闭后，滴加一抗（1∶200），置于4℃冰箱孵育过夜。利用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，滴加相应种属二抗（1∶400），室温下孵育60 min，并用PBS进行3遍冲洗。滴加新鲜配制的显色液，利用苏木素染料复染，中性树胶封固，最后置于显微镜下观察。染色强度评分：强阳性、中等阳性、弱阳性和阴性评分分别为3分、2分、1分和0分，阳性细胞数的评分：>75%～100%、>50%～75%、>25%～50%、5%～25%和<5%评分分别为4分、3分、2分、1分和0分，染色强度评分和阳性细胞数的评分的乘积即为总分，0～7分为低水平，8～12分为高水平。

1.3统计学方法应用SPSS 21.0软件行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用配对t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验，多组间的两两比较检验水准α=0.016；采用Kaplan-Meier法绘制疾病无进展生存率和总生存率曲线，log-rank检验比较不同组间的生存率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1qRT-PCR检测肝细胞癌组织中CDC20mRNA的表达CDC20 mRNA在肝细胞癌组织表达水平（2.33±0.67）高于对应的癌旁组织（0.97±0.29）（t=5.95，P<0.001）。

2.2蛋白质印迹法检测肝细胞癌组织中CDC20的表达CDC20蛋白在肝细胞癌组织中相对表达水平（0.91±0.05）高于对应的癌旁组织（0.14±0.05）（t=34.30，P<0.001）。

2.3免疫组织化学检测肝细胞癌组织中CDC20的表达CDC20在肝细胞癌阳性表达率（77.4%，113/146）高于对应癌旁组织（8.2%，12/146），差异有统计学意义（χ2=142.69，P<0.001）。见图1（仅展示3例病人的结果）。

图1 细胞分裂周期基因 20（CDC20）在3例肝细胞癌组织中的表达情况（免疫组织化学×200）

2.4CDC20表达与病人临床病理特征的关系CDC20的表达与病人的肿瘤长径、被膜侵犯、脉管侵犯、肿瘤多发、分化程度和TNM分期有关（P<0.05），见表1。

表1 细胞分裂周期基因20（CDC20）表达水平与肝细胞癌病人临床病理特征的关系/例（%）

2.5CDC20表达对病人术后生存率的影响CDC20高水平组总生存率为（61.7%）和疾病无进展生存率（50.0%）均低于CDC20低水平组（87.2%、69.8%）（log-rankχ2=14.19，P<0.001；log-rankχ2=9.61，P=0.005）。

3 讨论

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，在过去的20年中，观察到与肝细胞癌相关的年死亡率显著增加［13-14］。此外，根据美国国立癌症研究所“监测、流行病学和结果数据库”SEER注册机构项目研究，到2030年肝细胞癌的发病率将继续上升［15］。准确估计预后，在肝细胞癌治疗中起着至关重要的作用。寻找预测肝细胞癌预后的生物标志物具有重要的临床价值。许多CDC20底物都参与有丝分裂过程，包括细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白A、分离酶抑制蛋白（Securin）、双能蛋白（Geminin）和周期素依赖激酶抑制剂p21（P21）［16］。最近，越来越多的研究显示CDC20在人类癌症中起致癌作用，在多种人类肿瘤中观察到CDC20的过度表达，与生存率降低有关［17］。

CDC20在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌中的表达均增加［9-12］，在该研究中，肝细胞癌组织中CDC20 mRNA和蛋白质水平均高于癌旁组织，提示CDC20促进肝细胞癌的发生发展。目前多项研究显示，CDC20高水平参与多种肿瘤的进展，例如Kim等［12］研究显示，CDC20在肠化生、低度不典型增生、高度不典型增生和早期胃癌中的表达明显高于正常黏膜，且在高度不典型增生中的表达水平最高，且CDC20过表达与胃癌病人的年龄、肠道组织学、较低的肿瘤-淋巴结-转移阶段以及较长的无复发生存期和癌症特异性生存期相关。CDC20与前列腺癌的恶性进展相关，CDC20高水平病人更具侵略性的临床病理特征和不良预后［11］。Li等［18］证明了膀胱尿路上皮癌病例中CDC20升高，而CDC20高水平与病人的无复发生存期较短和总体生存期较差相关。该研究中，CDC20在肝细胞癌中的表达水平与肿瘤长径、被膜侵犯、脉管侵犯、肿瘤多发、分化程度和TNM分期有关，说明在肿瘤长径、被膜侵犯、脉管侵犯、肿瘤多发分化程度低和TNM晚期的病人中CDC20的表达水平更高。提示CDC20可能与肝细胞癌的增殖与侵袭有关，CDC20高水平的肝细胞癌病人具有较强的增殖活性和更强的侵袭能力，与肝细胞癌的发展密切相关。在该研究中，CDC20高水平病人的术后3年总生存率和疾病无进展生存率均较低，提示CDC20有可能成为评价肝细胞癌预后的有效标志物。CDC20促进肝细胞癌的进展，其失活可能对治疗肝细胞癌有一定疗效。目前已发现几种CDC20抑制剂，例如类毒素-抗毒素混合物酯酶、pro-TAME和2-［苄基-（2-硝基-苯磺酰基）-氨基］-N-羟基-3-甲基-N-丙基-丁酰胺［19-20］。对CDC20抑制剂的研究可能有助于阐明CDC20在人类癌症中的作用机制，这也是后期该研究的方向之一。

综上所述，CDC20在肝细胞癌中的表达水平增加，可能参与肿瘤的增殖和侵袭。CDC20高水平预示病人的预后不良，有望成为判断肝细胞癌预后的肿瘤标志物。