薄荷醇对TRPM8小鼠呼吸道上皮短路电流的影响

郅 琳， 臧文华， 张雪鹏， 胡久略

(南阳理工学院张仲景方药与免疫调节重点实验室 河南 南阳 473004)

0 引言

支气管哮喘是临床中一种常见的慢性气道炎症性疾病[1-3]。现代研究认为，温度变化可以引起细胞内信号通路的激活，而哮喘的病理可能与此有关[4]。研究认为这类温度感受离子通道属于瞬时受体势能(transient receptor potential，TRP)离子通道亚家族成员，是一种阳离子通道[5]。根据其序列同源性可分为7个主要的亚家族：TRPA(ankyrin)、TRPC(canonical)、TRPM(melastatin)、TRPML(mucolipin)、TRPN(nomechanopotential，NOMP)、TRPP(polycystin)、TRPV(vanilloid)[6]。

图1 TRP通道结构示意图

目前普遍认为温度感受TRP受体(thermoTRP receptors)包括TRPV1-V4、TRPM8、TRPA1[7]等6种受体，也有学者将TRPM2、TRPM4和TRPM5归于此类[8]。研究证明瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道(如图1)可以受温度、pH值、渗透压等多种因素的影响[9]。其中，在伤害性感觉神经元有表达的TRPV1、V2可分别被大于43 ℃和大于52 ℃温度激活，属于“热受体”范围，而TRPM8可在低于 25 ℃被激活，TRPA1在低于17 ℃可被激活，因此，TRPM8和TRPA1被称为“冷受体”[10]。2001年，Tsavaler认为TRP-p8很可能是一种与癌基因或肿瘤启动子相关并可通透钙离子(Ca2+)离子的通道，根据TRP通道的命名方法，TRP-p8归属于TRPM亚家族，因此命名为TRPM8[11,12]。随后，由于发现TRPM8可被冷温度、薄荷醇、桉树油等激活，因此又称其为“冷受体”(cold-and menthol-sensitive receptor，CMR)[13]。研究发现，冷空气的刺激和过度吸入都可以加重气道炎症或加重哮喘发作[14]，从而诱发哮喘。Ashwini等克隆出一种在人类肺组织上皮细胞上可以增强IL-6、IL-8表达的功能性TRPM8的变异体[15]，TRPM8在被激活后可以介导哮喘病的某些病理改变[16]，具有非常重要的药理学研究价值。来源于唇形科植物薄荷(Mentho haplocalyx Bing)[17]的薄荷醇(Menthol)，是TRPM8的经典激动剂，归属于中药活性成分范畴。根据中医理论，中药可划分为寒、热、温、凉四性，这也与TRP通道的冷(cold)、凉(cool)、温(warm)、热(hot)特性契合。由此可见研究中药和TRP通道之间的联系，对于临床疾病研究具有重要的指导意义。

支气管哮喘是一种由多种因素相互作用引起的免疫变态反应性疾病，临床以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为其病理特征，其中以气道炎症为其最主要的病理变化，并决定气道阻塞和气道高反应性的严重程度。本课题提出假设认为TRPM8在哮喘病程中尤其在炎症过程中具有调控作用，这种调控作用很可能是通过神经机制所介导，并且在此基础上，设想具有寒热温凉性质的中药及其活性成分可能会影响TRPM8通道的作用，进而导致其功能的修饰和改变。本研究利用TRPM8基因敲除小鼠的哮喘模型研究TRPM8对过敏性支气管哮喘小鼠模型的病理影响。采用基因敲除技术构建动物模型，从呼吸道上皮细胞及呼吸道平滑肌两个方面展开研究，考察其各自的功能改变，TRPM8+/+、TRPM8-/-小鼠采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏，激发液雾化激发建立过敏性支气管哮喘模型，在本研究中，根据中医理论，针对TRPM8为冷受体的特性，探索中药薄荷的活性成分薄荷醇(Menthol)与TRPM8通道在哮喘疾病发生中的联系，以期在中药药性理论的指导下，阐明薄荷醇对温度敏感离子通道的作用。

1 材料

1.1 实验动物

健康6～8周龄TRPM8+/+、TRPM8-/-小鼠，由上海交通大学基础医学院徐天乐教授惠赠，实验经上海中医药大学实验管理动物伦理委员会批准。

1.2 主要药品与试剂

薄荷醇(Sigma，Lot：05617 MHV)；Icilin(Cayman Chemical，lot：10147-5)；Krebs-Henseleit液；其余试剂均为国药制剂。

1.3 主要仪器

短路电流测定系统：放大器(CEZ-9100，日本光电)；多通道电流/电压钳(VCCMC-6，Physiologic Instruments)；Ussing型浴槽(P2300，Physiologic Instruments)。

1.4 TRPM8小鼠呼吸道上皮短路电流测定

1.4.1 Ussing小室短路电流测定

采用恒温灌流装置体外测定上皮短路电流Isc，小鼠气道黏膜面朝向A室，黏膜标本置于Ussing小室的标本夹上，标本夹的内径为4.2 mm2，加入Krebs-Henseleit缓冲液，两室各5 mL；缓冲液温度需保持在37 ℃，持续通入95% O2+5% CO2混合气。小鼠处死后，迅速取下呼吸道上皮，固定在标本夹上，置于Ussing室内，两侧加入缓冲液，平衡60 min，通过Ag/AgCl参考电极测量跨上皮电压差。短路状态可用外来电流以及液体电阻补偿钳于零电位，测得的电流即为短路电流(Isc)。

1.4.2 薄荷醇对TRPM8小鼠呼吸道上皮短路电流影响

以不同浓度薄荷醇(0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，3.0，10 mmol/L)加入A室的缓冲液中刺激呼吸道上皮，由电子计算机持续记录Isc。

1.4.3 薄荷醇对卡巴胆碱诱导的TRPM8小鼠气道上皮短路电流增强的影响

薄荷醇预孵育30 min后，加入10 μmol/L卡巴胆碱，观察Isc变化，以10 μmol/L卡巴胆碱引起的最大反应为对照。

1.4.4 统计学分析

数据分析采用GraphPad Prism5.0，实验结果均以Mean± SEM表示，组间数据采用双侧t检验，多组之间数据的采用one-way ANOVA检验，P<0.05，具有显著性差异。

2 结果

2.1 薄荷醇对TRPM8小鼠气道上皮短路电流变化的影响

结果表明，薄荷醇降低TRPM8+/+小鼠气道上皮Isc呈浓度依赖性，而TRPM8-/-小鼠无此反应(见图2)。

图2 薄荷醇对TRPM8小鼠气道上皮短路电流变化的影响

2.2 薄荷醇对卡巴胆碱诱导的TRPM8小鼠气道上皮短路电流增强的影响

结果表明，高浓度薄荷醇(3000 μmol/L)能显著降低卡巴胆碱刺激引起的TRPM8+/+小鼠气道上皮Isc(P<0.01)，而TRPM8-/-小鼠无此反应(见图3)。

图3 薄荷醇对卡巴胆碱诱导的TRPM8小鼠气道上皮短路电流增强的影响。

3 讨论

本项目利用TRPM8小鼠首先对TRPM8的通道功能特性进行研究，薄荷醇呈剂量依赖性的影响TRPM8+/+小鼠气道上皮的Isc变化，并且可有效降低CCh刺激引起的Isc水平，而在TRPM8-/-小鼠，这种作用不显著(图1和图2)，说明TRPM8同样参与了小鼠气道上皮离子转运过程。值得关注的是，TRPM8+/+小鼠中低浓度薄荷醇刺激诱导的Isc呈激活趋势，而高浓度情况下反而起到抑制作用。Chiyotani等人[18-20]的研究发现薄荷醇可以通过Ca2+依赖性机制影响犬科气道上皮氯离子分泌，进而影响气道上皮Isc水平，并发现薄荷醇刺激引起的持续性Ca2+内流可能来源于细胞外，因此认为气道上皮上可能存在Ca2+敏感性受体，考虑到TRPM8的通道特性，结合我们的研究，进一步推测薄荷醇对气道上皮的调节是通过TRPM8发挥生物学活性，低浓度的薄荷醇刺激气道上皮引起TRPM8通道的激活，通道开放引起钙离子内流，进而影响上皮离子转运例如氯离子分泌增加，导致Isc上升，而后期随着高浓度的薄荷醇持续刺激，TRPM8通道脱敏，导致钙离子内流减少，最终导致Isc的下降。

冷空气的刺激可诱发哮喘、慢性阻塞性肺病等，TRPM8作为“冷受体”，可能与温度敏感相关疾病的发作有重要关系。Reid等[21]相关研究证实，TRPM8通道在23～34 ℃之间可以被薄荷醇激活，从而诱导背神经元内TRPM8的电流发生，而在对三叉神经元上TRPM8的研究中，McKemy[19]通过TRPM8电流在冷刺激、薄荷醇的敏感性以及离子的选择性等方面与内源性的冷激活产生的电流相对比，发现二者是相同的。可见，作为一种冷受体，TRPM8通道的研究在炎症尤其是与气道相关疾病中具有重要意义。

目前对TRP通道的认识仅可以确定TRP通道参与了多种病理生理过程，如介导感觉信息传递、调节细胞内Ca2+平衡、影响发育等。有关研究中发现，包括薄荷醇在内的一些化合物也可激活TRPM8通道[22]，另外，一些合成化合物，例如Icilin激活TRPM8能力是薄荷醇的20到200倍，同样也可以作为TRPM8的激动剂[19]。在中国，自然界药物资源丰富，很多中药均可衍生出多种人工合成物，因此利用中医中药研究TRP通道的相关功能具有很广阔的前景[23]。

总之，通过本研究对比分析，发现利用薄荷醇激活TRPM8通道，可以调控小鼠气道上皮短路电流，从而为进一步研究其在哮喘疾病中的作用机制等提供了科学依据。