探究中性粒细胞胞外诱捕网加重特发性膜性肾病内皮功能紊乱并促进高凝状态形成*

禹程远，陈晓静，王姣姣，解汝娟

1.深圳市人民医院老年病科，广东深圳，518020；2.西安市红会医院内科，陕西西安 710000；3.哈尔滨医科大学附属第一医院内科，黑龙江哈尔滨 150000

特发性膜性肾病（IMN）是临床上常见的肾小球滤过屏障损伤的疾病，是成人肾病综合征（NS）最为常见的病因，其血栓栓塞并发症高达7%～50%［1］。疾病的发展与静脉血栓栓塞事件发生的风险相关［2］。目前IMN的血栓发生机制主要包括凝血功能增强（因子V、VIII，纤维蛋白生成增加，血小板聚集等）、抗凝作用减弱（抗凝血酶III、蛋白C的丢失）［3］，微粒表达增加等［4］。但是，常规的抗血栓治疗后仍会有心血管事件的发生，且对于治疗时机的选择仍存在争议［5］，因此，进一步了解IMN血栓形成机制尤为重要。临床中约有70%的IMN患者循环中抗磷脂酶A2受体（PLA2R）抗体阳性，该抗体已成为IMN诊断治疗的一项指标［6］，但血清抗体水平并不能及时准确反映疾病进展，且与肾组织中抗体表达不一致［7］，因此寻找新的指标对于监测疾病进展尤为重要。近年来，在多种免疫相关性血栓疾病中发现中性粒细胞在各种氧化应激环境中可生成一种网状结构，称为中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），由DNA、组蛋白及颗粒蛋白等部分组成，具有抗炎、促凝等功能，其网状结构能够捕获血小板、红细胞和纤维蛋白等促凝物质，亦能够与循环中微粒结合为复合体，激发凝血瀑布反应，其中组蛋白也能促进内皮细胞表达促凝表型，最终导致血栓形成［8-9］。研究表面IMN患者外周血中性粒细胞被大量激活［10-11］，且在发病后有活性氧簇（ROS）系统的激活，而后者是NETs形成过程中重要机制［12］，基于以上观点，研究者提出IMN患者体内存在NETs高表达，可将其可作为一种新的监测指标反映肾脏损伤情况以及评估血栓前状态。正常肾脏存在三层滤过屏障，肾脏有孔内皮细胞、基底膜以及上皮细胞，内皮表面存在糖萼、硫酸软骨素及透明质酸等成分使得有孔肾脏内皮连接紧密，蛋白无法漏出，当内皮受刺激后，糖萼成份被破坏，硫酸软骨素及透明质酸被降解，内皮间隙增宽，大分子蛋白才得以漏出，随着基底膜、足细胞的进一步破坏，出现蛋白尿［13］。研究者考虑内皮损伤是IMN疾病进展的关键一步。正常内皮对维持正常血流过程及出凝血平衡，因此IMN多部位血栓事件的发生与内皮损伤密不可分。本研究拟探究NETs在加重IMN内皮功能紊乱并促进高凝形成、疾病进展中的作用，为IMN的诊治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

筛选年龄在18～80岁之间且于2019年3月—2020年12月在哈尔滨医科大学附属第一医院肾内科行肾活检病理诊断为IMN，且病理分期为II、III期的患者，行双下肢彩超或双肾血管彩超，根据彩超对于急慢性血栓的诊断标准排除陈旧血栓影响，分为有血栓组、无血栓组各20例为IMN组，再选取健康者20例为对照组。所有人员均对此项研究知情且同意。排除标准：年龄＜18岁或＞80岁，合并其他已知肾脏疾病（如糖尿病肾病、IgA肾病等）、恶性高血压、糖尿病患者，尿路感染，尿路结石，免疫相关性疾病、恶性肿瘤病史，铁、叶酸和维生素B12缺乏，近一个月内抗凝剂、溶栓治疗、肾毒性药物与非甾体抗炎药。

1.2 主要试剂

RPMI1640细胞培养基、DMEM细胞培养基、胰酶细胞消化液、胎牛血清（美国Gibico）。人脐静脉内皮细胞ScienCell（CA，USA）。 PMA、DNase I、中性粒细胞分离液、红细胞裂解液（Sigma-Aldrich）。 PBS缓冲液（Solarbio）；中性粒细胞髓过氧化物酶试剂盒（Boster）。中性粒细胞弹性蛋白酶试剂盒、TAT复合体检测试剂盒（Blue-Gene）。 Quant-iT PicoGreen ds-DNA 试剂盒（Invitrogen）。VE-cadherin、Anti-TF、CD31、anti-human MPO、anti-human NE（abcam）。 DAPI（Hoechst）。

2 方法

2.1 外周血采集

所有研究对象于治疗前，禁食8～12 h后留取肘静脉血5 mL，采血管中含有3.2%的柠檬酸钠，并缓慢摇匀。在采集30 min内，将样品在室温下离心（200×g，10 min）得到富血小板血浆，再次离心（2 500×g，2次，每次15 min）得到乏血小板血浆，将其储存在-80℃。

2.2 体外NETs生成及提取

采用Percoll梯度密度离心法收集血液中的中性粒细胞，并通过赖特-吉姆萨和台盼蓝染色检测这些细胞的活性和纯度，其结果不低于98%。中性粒细胞（1×106）接种于聚L-赖氨酸修饰的24孔板中，37℃孵育30 min，然后用IMN有血栓组、无血栓组或对照组的血浆对中性粒细胞进行处理，并在37℃、5%CO2孵箱中培养4 h，用RPMI洗涤细胞，每孔加入RPMI 2 mL。然后大力摇动样品，将上清液以20×g的速度离心5 min后收集上清液中的网状物，并储存在-20℃冰箱中备用。

2.3 免疫荧光实验

为了进一步观察NETs的形成，使用免疫荧光显微镜观察其结构。首先将中性粒细胞接种到聚L-赖氨酸修饰的24孔板中，用显微镜观察细胞基本贴壁后，用磷酸盐缓冲（PBS）溶液对多聚赖氨酸氨酸爬片清洗三次，每次3～5 min。中性粒细胞在有或无刺激的情况下，加入4%多聚甲醛固定（10～15 min），PBS清洗1～2次。每孔加入100μL BSA溶液封闭30 min，吸掉封闭液，紧接着加入1∶100的弹性蛋白酶抗体（2%BSA配置），湿毛巾包裹后4℃过夜。吸走一抗，并进行PBS清洗，加入MPO-DNA抗体，室温下孵育30 min，PBS清洗后在避光环境下每孔加入100μL DAPI溶液，通透5 min后PBS清洗1～2次，加入二抗后，所有操作需避光，在避光环境下抠片，将防淬灭甘油滴在载玻片上，然后封片剂封片。免疫荧光显微镜对其进行荧光定量分析，观察计算中心粒细胞释放NETs占同视野全部细胞的百分比，并进行三次重复试验。

2.4 凝血时间及TAT复合物测定

如先前概述方法进行凝时间及TAT测定［14-15］。

2.5 内皮细胞免疫荧光测定

（1）内皮细胞培养：内皮细胞的复苏传代，显微镜下观察内皮培养基情况，细胞生长至均匀的平铺一层，进行下一步实验操作。用镊子将普通细胞爬片置于24孔板中，PBS进行冲洗（2～3次），每次5 min，清洗后备用。弃掉内皮培养基中的培养液，清洗2次，加入1～2 mL胰酶消化，轻轻拍打瓶身，并实时在镜下进行观察，致大量细胞形态变为椭圆状悬浮于培养液后，加入2 mL培养液终止胰酶消化。吸取液体离心（800×g，3～4 min），弃上清，于离心管中加入3～5 mL培养液，吸管吹打，用枪头吸10μL左右液体，进行细胞计数板计数，将ECs稀释到细胞浓度为106/mL，将稀释后的细胞均匀的移入24孔板。当细胞生长覆盖70%～80%，将之前提取出的NETs作为刺激物，刺激铺板后的内皮细胞24 h。（2）内皮细胞免疫荧光步骤：细胞爬片进行刺激处理后，PBS冲洗3次，多聚甲醛固定30 min，再次冲洗之后加入BSA封闭30 min，用VE-cadherin、TF、CD31的抗体对HUVEC进行染色。将样本与Alexa Fluor647、488或555结合的二抗孵育，最后加入DAPI 30 min后防淬灭甘油封片，免疫荧光显微镜观察ECs的形态变化。用流式细胞术对CD31、VE-cadherin进行检测，结果用平均荧光强度表达，重复4次实验。

2.6 外周血NETs相关指标测定

cfDNA、MPO-DNA复合体、NE均作为患者血浆中NETs的替代指标［16］。将采集好的血浆和试剂盒恢复至室温，根据制造商说明，使用Quant-it PicoGreen dsDNA试剂盒定量测定IMN患者血浆样本中的cf-DNA水平。ELISA用于定量血浆MPO-DNA复合物，如之前的描述［17］。根据提供的说明，还使用特异的ELISA试剂盒检测NE。450 nm波长下读取OD值，进行MPO-DNA复合物及NE浓度计算。

2.7 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 基本信息

IMN组患者血浆白蛋白、血脂、中性粒细胞、PLT、APTT、Fibrinogen、D-dimer等与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，0.01，0.001，0.0001），但有血栓组与无血栓组间对比无明显差异，见表1。

表1 IMN患者和对照组受试者的基本特征

3.2 IMN患者外周血中NETs指标变化

与对照组相比，IMN伴有血栓和不伴有血栓患者外周血MPO-DNA复合物、cell-freeDNA、NE水平均明显升高差异有统计学意义（P＜0.01），有血栓组较无血栓组水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 IMN患者和对照组循环血液中的NETs相关指标

3.3 IMN患者血浆刺激对NETs生成的影响

IMN患者组可见明显的丝状结构，并用免疫荧光观察DNA、MPO、NE，发现MPO、NE均黏附在DNA链上，其含量较对照组明显增加，同时对能够产生NETs的中性粒细胞百分比进行比较，IMN组患者与对照组比较，差异无统计学意义（P＜0.01），有血栓组与无血栓组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 IMN血浆更有可能促进中性粒细胞的细胞外陷阱。（免疫荧光×400）

3.4 IMN患者外周血中NETs对凝血功能的影响

与对照组相比，IMN组患者CT明显缩短，有血栓组比无血栓组时间缩短更明显。用anti-TF、DNase可有效抑制NETs导致的促凝影响，且DNaseI作用更强。而IMN组患者较对照组患者凝血酶-抗凝血酶水平更高，有血栓组较无血栓组更明显，用anti-TF、DNase可减少TAT复合物生成，见图3。

图3 NETs促进了IMN患者的促凝血活性

3.5 NETs异常生成对内皮功能的影响

NETs刺激组ECs皱缩，细胞间距离增大，CD31的表达降低，TF表达增加，使得内皮细胞向促凝活性转变，且VE-cadherin的表达降低，细胞边缘显著延长。流式细胞仪对CD31、VE-cadherin表达定量分析，显示二者菌显著降低，见图4。

图4 NETs损害内皮细胞并促进其促凝表型（免疫荧光×400）

4 讨论

本文通过对IMN高凝状态的探究，提出了NETs可作为免疫与血栓联系的桥梁，可作为一种新的监测指标，反映疾病进展程度。研究者得出以下结果：（1）IMN患者血浆更容易促使中性粒细胞表达NETs，且随着凝血的加重，NETs升高更明显，也说明NETs能更敏感地反映高凝状态的形成。（2）NETs可明显缩短CT，促进凝血酶的生成，而抗组织因子抗体和DNase I可减弱NETs促凝作用。（3）NETs高表达可损伤内皮细胞，使得内皮结构改变，同时向促凝表型转化。NETs不仅可作为疾病早期血栓并发症程度的监测指标，同时也能为抗血栓治疗提供新的方向。

之前对于IMN血栓相关性的研究认为，其与血小板活化、凝血因子启动、抗凝物质减少、纤溶抵抗［17］等因素有关，近些年又有人提出微粒促进高凝状态形成［18］，现有抗栓治疗并不能很好地解决血栓并发症的发生，目前临床上主要以血浆白蛋白水平作为预防性抗凝治疗指标，但治疗效果不佳，因此对于治疗时机的选择仍存在争议。这就需要我们进一步探究IMN患者血栓发生机制，寻找新的监测指标。IMN患者是一种免疫相关的肾脏疾病，随着免疫系统的激活，多种炎症因子、炎症介质高表达，促进凝血系统的激活［19］，但目前主要聚焦于T、B细胞的研究，固有免疫细胞参与疾病的过程涉及相对较少，越来越多的研究发现IL-17A在肾脏损伤中发挥重要作用，与其伴随的中性粒细胞的聚集有关［20］。有Th17介导的炎症的MN患者有更多的静脉血栓事件的发生，利妥昔单抗治疗可诱导Th1和调节性T细胞细胞因子，但并不能有效抑制Th17细胞，伴有IL-17升高的MN患者预后较差。IL-17与中性粒细胞作用密切相关，如果对中性粒细胞参与IMN患者发病机制进行相关性研究，抗体合并相应抑制剂治疗是否能改善预后［21］。因此研究者将中性粒细胞作为主要研究对象。而内皮作为第一道屏障，在凝血-抗凝平衡的维持，血栓的发生过程起到重要作用，因此研究者认为内皮在IMN患者血栓的发生中也起着重要作用。本文主要探究了中性粒细胞与内皮细胞的相互作用对IMN患者高凝状态形成的影响。

NETs在心脑血管、肾脏相关等疾病［22］中已有不少报道，从开始的抗炎研究，到后期的促炎、促凝的研究，对于NETs的了解越来越深入。在IMN中对于NETs的研究目前仍较少，2002年有相关研究报导游离的磷脂酶A2（sPLA2-IB）与中性粒细胞表面相关受体—PLA2R1结合，使得p38MAPK信号激活，进而刺激了NE释放和细胞粘附，同时sPLA2与受体结合，激活下游分子后具有促凋亡作用。在多种疾病研究中发现中性粒细胞存在一种新的死亡方式，称之为NETosis，其在炎症和血栓中发挥重要作用。IMN患者血浆抗PLA2R抗体明显增加，那么IMN中增加的抗PLA2R抗体是否能与中性粒细胞反应，发生类似凋亡作用，目前仍未被证实，这也许是IMN患者外周血中NETs生成增加的重要原因。本文主要证明了IMN患者中存在NETs的高表达，但并没有对其生成机制进一步探究，最近的报道证明，空气中的PM2.5生成可促进IMN患者体内氧化应激反应，进一步促进NETs生成，NETs的生成促进PLA2R抗体表达［12］。因此对于抗体与NETs出现的先后顺序仍具有争议，这也是本次研究我们未将抗体与中性粒细胞进行分析的原因，我们需要进一步探究，后期需通过构建动物模型进行研究，目前血浆抗体水平变化与蛋白尿变化，疾病缓解并不一致［23］，如果能够将抗体与NETs的相互关系了解清楚，那么对于IMN的治疗将会有很大意义。

肾脏内皮细胞作为三层滤过屏障之一，在蛋白尿的形成中发挥重要作用。生理情况下，其存在电荷屏障和分子屏障，在IMN中，先是电荷屏障破坏，一些小分子蛋白能够滤过，随着疾病的加重，内皮结构改变，间隙增宽，会导致大分子蛋白也滤过，虽然对于滤过屏障的研究，大多数人认为足细胞骨架发挥重要作用，但不可否认，内皮作为第一道屏障，只有当其破坏越严重，才能出现越来越多的蛋白向足细胞屏障滤过。同时内皮也是凝血-抗凝系统平衡的重要调节物质，而IMN患者中NETs的高表达导致内皮损伤，因此呈现出大量蛋白尿以及高凝的表现。而DNaseI、抗组织因子抗体的抑制能够减轻NETs损伤，这也许能够作为一种新的治疗手段。内皮表面表达CD31，VE-cadherin是细胞间重要的连接分子，我们的体外细胞研究发现，当NETs刺激内皮细胞后，CD31、VE-cadherin水平均降低，同时内皮发生皱缩、间隙增大等结构改变，证明了NETs通过对内皮结构的破坏影响其功能。

之前对于IMN患者高凝机制的研究多以肾病综合征病理类型划分，或以疾病病理分期进行研究，考虑到我们入院患者中IMN患者病理类型多以II、III期为主，且I期、IV期患者的临床表现以及病理并不典型，以及多合并其他疾病发生，如微小病变性肾病或狼疮性肾炎，因此我们选择了较为典型的II、III期IMN患者，且临床指标多提示高凝，我们根据彩超结果排除陈旧性血栓的影响将其分为有血栓组和无血栓组，结果证实了NETs升高越明显，血栓发生几率越大。在患者筛选中对照组患者较实验组年龄偏低，是由于样本量问题，在筛血栓组过程中扩大了年龄范围，因此实验组年龄普遍偏高，但在有血栓组和无血栓组中，年龄不作为影响疾病严重程度的因素，对照组与实验组本身也不能排除年龄对于血管状态的影响，但对于NETs生成的影响作用不大，其仍主要是与中性粒细胞氧化应激反应有关。而且无血栓组与对照组年龄并无明显差别，可通过这二者的对比，相对排除年龄因素对于疾病指标的影响。

综上所述，研究证明了IMN患者外周血中高表达的NETs可反映肾脏内皮损伤程度，同时能够及时监测高凝状态的形成，通过有效地抑制，对于疾病的缓解具有重要意义，且有望缩短目前治疗病程，减少并发症的发生。为预防和治疗开拓了新的思路，提供了新的靶点。