苦豆子生物碱抗小鼠溃疡性结肠炎的作用研究

苏永霞，苏日拉格，沙日扣，马永嘉，吴晨晨，路 浩，赵宝玉*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.平凉市崆峒区动物疫病预防控制中心，甘肃平凉 744000；3.阿拉善左旗银根苏木综合保障和技术推广中心，内蒙古阿拉善 750300；4.阿拉善左旗动物疫病预防控制中心，内蒙古阿拉善 750300)

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种发生在胃肠道的非特异性炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn′s disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)[1]。有文献报道，IBD的发病原因主要与肠道微生物异常、免疫反应失调、环境变化和基因变异有关[2]。目前，该病每年在全球范围内的发病率增长较快，且发病年龄趋于年轻化，发病率在5岁以下儿童中增长最快[3]。据估计美国有超过100万居民以及欧洲有250万居民患有IBD，该病目前已演变成一种全球性的疾病，病情严重者会有不同程度的肠外表现及全身表现，对患者的生活质量造成了严重的困扰[4]。其中，UC的病程较长、反复发作，病程严重者最终与直肠癌的发生密切相关[5]。UC的常用治疗药物包括糖皮质激素、氨基水杨酸盐、抗生素、免疫调节剂和生物制剂等，但是长期使用部分患者会对药物产生依赖性，一旦停止用药则会复发，也有患者在治疗期间会发生病情恶化情况[6]。因此，目前急需探索出新的药物，缓解IBD的发生发展。近年来，传统中药因其毒副作用小、安全环保及动物体不易产生抗药性等优势，已成为全社会的研究热点，特别是中草药的抗炎活性也受到广泛关注。多种试验证明中草药具有很好的抗炎作用，因此，通过开发中草药的抗炎功效来治疗炎症性肠病，将为炎症性肠病的治疗和中草药的开发奠定基础，同时也对国家禁抗减抗限抗行动和畜禽健康养殖的发展具有重要意义。

苦豆子(Sophoraalopecuroides)是豆科槐属多年生草本植物，别名苦甘草、苦豆根和草槐等，作为传统的药用植物，主要分布在我国新疆、内蒙古、宁夏、陕西和甘肃等西北荒漠地区。据统计我国苦豆子分布面积约为180万hm2，资源蕴藏量大[7]。《本草纲目》记载，苦豆子有清热解毒、抗菌消炎和止痛镇静等药理功效，常被民间用来治疗痢疾和胃痛等疾病[8]。苦豆子药用价值极高，宁夏回族自治区已将苦豆子列入重点保护的六大地道药材之一，是宁夏中药产业发展的重点[9]。苦豆子的主要活性成分是生物碱，包括槐定碱、槐果碱、苦豆碱、槐胺碱以及苦参碱等多种单体生物碱[10]。现代药理研究显示，苦豆子总碱(total alkaloid ofSophoraalopecuroides，TASA)具有抑菌抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用，尤其对机体的慢性炎症治疗作用显著，其对肝脏[11]、肺脏、胰腺[12]和肠道[13]的炎性损伤治疗作用较好。因此，本研究通过葡聚糖硫酸钠盐溶液(dextran sodium sulfate，DSS)建立小鼠急性期UC模型，同时采用不同剂量TASA进行处理，观察小鼠结肠组织的损伤程度以及炎症细胞因子的表达，探究TASA对UC的治疗作用，为UC治疗提供新思路，同时也为苦豆子资源的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物碱 2019年10月，在内蒙古阿拉善吉兰泰镇(105°45'54.320 4"E，39°45'43.812"N)采集苦豆子种子，经本实验室提取得到苦豆子种子总生物碱(西北农业科技大学动物医学院动物中毒病实验室)。

1.1.2 实验动物 清洁级健康昆明小鼠，雌雄各半(雌性25只，雄性25只)，体重20 g±2 g，购自成都达硕实验动物中心，饲养室温度20 ℃～25 ℃，相对湿度40%～70%，于试验前适应性饲养7 d。

1.1.3 试验试剂 葡聚糖硫酸钠盐，大连美仑生物技术有限公司产品；IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒，西安恩典生物科技有限公司产品；粪便潜血定性检测试剂，北京雷根生物技术有限公司产品；HE染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；二甲苯、无水乙醇、甲醛(分析纯)，成都市科隆化学品有限公司产品。

1.1.4 仪器设备 RM2016型轮转切片机，徕卡显微系统有限公司产品；YT-7FB型生物组织摊烤片机，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司产品；DGP-9057B-2型干燥箱，上海福玛实验设备有限公司产品；Ni-U正置显微镜，南京斯高谱仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 溃疡性结肠炎模型建立与分组给药

1.2.1.1 溃疡性结肠炎模型建立 根据文献[14]中介绍的方法，将DSS溶于生理盐水中配制成40 mg/mL的DSS溶液，现配现用，小鼠连续自由饮用40 mg/mL的DSS溶液7 d，建立急性期UC模型。

1.2.1.2 动物分组给药 昆白小鼠随机分为对照组，模型组，TASA高、中、低剂量组(60、30、15 mg/kg)，每组10只小鼠。对照组小鼠自由饮水7 d，模型组小鼠自由饮用40 mg/mL的DSS溶液7 d，TASA治疗组小鼠在自由饮用40 mg/mL DSS溶液的同时,分别按上述剂量的苦豆子生物碱灌胃7 d。于试验第8天处死小鼠，采样进行相关指标的检测。

1.2.2 疾病活动指数评估 试验期间，通过疾病活动指数(disease activity index，DAI)分数来评估小鼠溃疡性结肠炎的临床进展。造模及治疗后每天观察小鼠的精神状态、进食情况、测定小鼠的体重、观察粪便的性状并进行粪便隐血检查。DAI的具体评定方法参考相关文献[15]，按照评分标准对小鼠体重变化、粪便性状以及粪便隐血情况进行评分，随后将相关分数相加除以3即为DAI评分，DAI评分值越高表示小鼠临床症状越严重。具体评分标准见表1。

表1 DAI评分标准

1.2.3 结肠长度变化测定 试验第8天，处死小鼠，取肛门至结肠部分的肠管，测量结肠的长度，随后沿肠系膜纵行剪开，用无菌PBS冲洗结肠除去粪便，观察肠道黏膜的出血和损伤情况。

1.2.4 结肠组织病理变化观察 试验第8天，处死小鼠，距离肛门5 cm处取小鼠结肠段，用100 mg/mL的中性甲醛固定，随后用梯度乙醇和二甲苯脱水透明，石蜡包埋组织块，随后进行组织切片(切片厚度为5 μm)和苏木素伊红(HE)染色。最后，使用显微镜观察结肠组织结构的完整性、肠黏膜充血水肿以及炎性细胞浸润等情况。

1.2.5 结肠组织中促炎细胞因子的检测 取已处理的小鼠结肠组织，加生理盐水使用组织匀浆机在冰上制备结肠组织匀浆，组织匀浆的浓度为100 mg/mL，随后将匀浆液以2 000 r/min离心20 min，吸取上清液，置-20 ℃保存，随后用ELISA试剂盒检测结肠组织中IL-1β和TNF-α含量。

1.2.6 数据处理 使用SPSS 20.0统计软件进行处理，各组间比较采用单因素方差分析比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 溃疡性结肠炎造模结果

小鼠自由饮用40 mg/mL的DSS溶液后，试验前4 d体重持续增长，从第5天开始小鼠体重下降，于试验第7天下降到最低。便血情况显示，试验第1～2天，小鼠未见便血情况，粪便隐血试剂盒测定隐血阳性(+)；试验第3天，2只小鼠出现轻微便血情况，小鼠被毛粗乱、精神状态较差；试验第4～5天，6只小鼠出现明显血便，且小鼠的活动明显减少；试验第7天所有小鼠都出现腹泻、肉眼血便。造模结束后处死小鼠，取出结肠部分，发现小鼠结肠严重缩短、肠道出现水肿情况，沿肠系膜纵行剪开肠道，发现肠道黏膜出血严重，部分肠段有溃疡形成，以上试验结果显示造模效果较好。造模组小鼠便血和结肠组织损伤情况见图1。

图1 造模组小鼠便血和结肠损伤

2.2 小鼠体重和DAI变化结果

与对照组相比，DSS模型组小鼠体重在试验前4 d稳定增长，从第5天开始体重剧烈下降，于试验第7天降到最低；与DSS模型组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠体重增长，且随着试验天数的增长模型组与TASA治疗组之间小鼠体重变化差异加大，各治疗组小鼠体重变化没有显著差异；与对照组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠体重增长缓慢(图2)。与对照组相比，DSS造模组小鼠DAI评分在试验期间持续上升，于试验第7天达到峰值；与DSS模型组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠DAI评分在试验前4 d有所上升，在第5天后DAI评分持续下降，且各治疗组小鼠DAI评分没有显著差异；与对照组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠DAI评分有所上升(图3)。说明采用苦豆子生物碱治疗后，对UC模型小鼠临床症状有所改善。

图2 小鼠体重变化

图3 小鼠DAI评分变化

2.3 小鼠结肠长度测量结果

试验期结束后，处死小鼠获取结肠部分，随后测量结肠长度变化(图4)。与对照组相比，DSS模型组、TASA高、中、低剂量组小鼠结肠长度明显缩短，且DSS模型组小鼠结肠缩短的更加明显(P<0.01)；与DSS模型组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠的结肠长度显著增加，差异极显著(P<0.01)；几个治疗组之间相比，TASA高剂量组小鼠结肠长度比TASA中、低剂量组的长，差异极显著(P<0.01)。结果说明，采用苦豆子生物碱治疗后能明显的改善DSS模型组小鼠结肠缩短程度，且高剂量组的改善作用更加显著。

A.对照组；B.模型组；C.高剂量组；D.中剂量组；E.低剂量组；对照组与其他几组相比，**P<0.01；TASA治疗组与DSS模型组相比，##P<0.01

2.4 小鼠结肠黏膜病理变化结果

试验期结束后，采用HE染色观察小鼠结肠组织病理学变化(图5)。与对照组相比，DSS模型组小鼠结肠壁增厚、肠黏膜上层细胞坏死脱落、腺体排列紊乱、杯状细胞大量缺失以及存在淋巴细胞浸润等，结肠组织的病理变化涉及到黏膜层及黏膜下层；与DSS模型组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠结肠组织的病理变化明显减轻，肠腺排列整齐，黏膜层上皮细胞缺失减少、炎症细胞浸润减轻；与对照组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠结肠主要变化就是肠管增粗、肠腔变小，其他病理损伤较轻，且各治疗组小鼠结肠组织的病理变化相似，没有表现出明显剂量差异性。

A.对照组；B.模型组；C、D、E分别为TASA高、中、低剂量组

2.5 小鼠结肠组织中促炎细胞因子检测结果

试验结束后，采用ELISA检测小鼠结肠组织中IL-1β和TNF-α的含量变化(图6)。与对照组相比，DSS模型组小鼠结肠组织中IL-1β和TNF-α的含量升高，且差异极显著(P<0.01)，表明DSS诱导结肠炎造模效果较好；与DSS模型组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠结肠组织中这两种炎症因子的含量都降低，差异极显著(P<0.01)，表明苦豆子生物碱治疗可以抑制炎症因子的分泌；与对照组相比，TASA高、中、低剂量组小鼠结肠组织中IL-1β和TNF-α稍微升高，但差异不显著，且各治疗组小鼠结肠组织中炎症因子的水平相似，没有表现出明显的剂量差异性。试验结果显示，这两种炎症因子在DSS模型组均较对照组明显升高，TASA干预后表达均较DSS模型组明显下降。

A.对照组；B.模型组；C.高剂量组；D.中剂量组；E.低剂量组；DSS模型组与对照组相比，**P<0.01；TASA治疗组与DSS模型组相比，##P<0.01

3 讨论

苦豆子作为西北地区的一种传统药用植物，主要药理活性成分是生物碱，现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抑菌抗炎、中枢抑制及对心血管系统疾病的保护等作用[16]。由于苦豆子抗炎效果较好，在民间常被用来治疗胃肠炎等疾病。因此，本研究进行了一系列的试验来证实苦豆子生物碱是否可以缓解由DSS诱导的急性UC，结果显示，其对UC模型小鼠表现出良好的治疗作用。

UC是一种病因尚不明确、病程长、易反复发作的以直肠和结肠黏膜弥漫性炎症为特征的慢性疾病，主要的临床表现为便血、腹痛和腹泻，其结肠的病理损伤主要为黏膜层化脓水肿、杯状细胞坏死缺失以及隐窝层炎性细胞浸润等[17-19]，如果不及时治疗可大大增加患结肠癌的几率。目前，UC也是世界范围内的一种公共性疾病，引起越来越多人的关注。在过去的几十年里为了研究该疾病，众多学者建立了大量的实验动物UC模型，主要包括化学试剂诱导法、复合法、免疫法、基因模型和中医模型等[20]。其中，化学试剂诱导的肠道炎症模型是最常用UC模型，在化学法中DSS诱导的UC模型因成本低、操作简单并且其病理表现与人类溃疡性结肠炎有许多相似之处而被广泛应用，可作为研究UC发病机制和治疗的工具[21]。DSS诱导结肠炎的发生可能与其进入肠道中造成肠黏膜单层上皮受损，从而导致促进炎症发生的肠道内容物(如细菌及其产物)扩散到下层组织有关[22]。本试验中，小鼠自由饮用40 mg/kg的DSS溶液后，体重下降明显、DAI评分升高以及结肠组织充血水肿严重，且造模过程中小鼠没有出现死亡现象，所以40 mg/kg的DSS溶液造模效果较好。随后，采用60、30、15 mg/kg的苦豆子总碱在造模的同时进行治疗，最终对小鼠实验性结肠炎表现出很好的改善作用。首先，苦豆子生物碱治疗后，小鼠的体重变化、DAI评分以及便血程度都有所改善。此外，UC模型小鼠结肠长度出现变短情况，采用苦豆子生物碱治疗能够缓解结肠缩短程度，并且可以减轻结肠组织的充血水肿、炎症细胞浸润及维持肠黏膜的完整性，肠黏膜作为肠道免疫的主要屏障，在养分消化吸收以及抵抗病原微生物入侵具有重要作用[23]，而苦豆子生物碱治疗能够维持UC模型小鼠肠黏膜的完整性。

大多数研究显示，UC的发生与基因遗传、环境影响、肠道免疫反应失调以及肠道菌群紊乱等有关，其中免疫因素扮演着重要的角色[24]。在炎症性肠病中，相关炎症信号通路的过度激活使炎症因子之间不平衡，最后会导致疾病进一步发展及结肠组织的损伤。肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-lβ(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)以及中性粒细胞激活肽-Ⅰ/白细胞介素-8(IL-8)已被证明是炎症性肠病的发生时引起肠道炎症反应的重要介质[25]。研究显示，在炎症性肠病患者中TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平显著升高，治疗后这些炎症细胞因子的产生明显降低[26-28]。在本试验中，模型组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β的水平升高，采用苦豆子生物碱治疗后这两种细胞因子的含量都有所下降，说明苦豆子生物碱治疗能够抑制结肠炎小鼠机体炎症因子的分泌。综上所述，通过缓解体内与溃疡性结肠炎密切相关的这些主要指标，证实了苦豆子生物碱对UC的治疗作用。