C3G通过PKA/CREB信号通路减轻成年小鼠SAH后早期脑损伤

杨新宇 韩雨薇 陈立刚 李佳朔 潘鹏宇 梁国标

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一类病死率较高的颅内出血性疾病，病死率高达50%，出血后早期脑损伤（early brain injury，EBI）是重要的死亡原因之一[1]。氧化应激是EBI 的重要的病理机制，导致抗氧化成分的减少以及脂质过氧化产物增加[2]，造成神经元凋亡，与SAH症状和预后直接相关[2]。据报道，cAMP/PKA 信号通路够参与抑制氧化应激的过程，抑制脑组织炎症反应过程[3，4]。矢车菊素，又名花青素，具有抗氧化、抗炎等作用[5，6]。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-Oglucoside，C3G）是矢车菊素家族中最常见的一种[7]。据报道，C3G 对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[8]；而且，C3G 能通过cAMP/PKA 信号通路抑制氧化应激反应[3]。本文探讨C3G 对小鼠SAH 后EBI 的影响及PKA/CREB信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 取72 只4～6 周龄、体重28～32 g的清洁级雄性c57鼠[长生生物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（辽）2020-0001]，随机分为假手术组、SAH 组、溶剂组、低剂量（10 mg/kg）C3G 组、中剂量（20 mg/kg）C3G 组、高剂量（30 mg/kg）C3G组。

1.2 SAH 模型制作 应用颈动脉穿刺法制作小鼠SAH 模型[9]。腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，取颈部正中切口，分离左侧颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉。夹闭颈总动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉远端根部。在颈总动脉分叉处上部穿入长1.5 cm、直径0.625 mm 的尼龙线，打开颈内动脉，并将尼龙线穿入，推进约10 mm 后，刺破颈内动脉/后交通动脉分叉附近的Willis 环，会有轻微落空感，小鼠呼吸节律会改变，然后取出尼龙线，结扎颈外动脉，开放颈总动脉，缝合切口。假手术组进行同样的操作，但不刺破血管。

1.3 药物干预及取材SAH后30 min，腹腔注射C3G，浓度分别为10、20、30 mg/kg[10，11]。溶剂组注射等体积生理盐水。SAH 后24 h，进行Garcia 和平衡木实验；然后，每组随机取6只小鼠取外周血进行活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量检测，再取出完整脑组织进行SAH出血量评分，立即称重检测脑水含量；每组剩余6 只取外周血进行还原型谷胱苷肽和氧化型谷胱苷肽比值（GSH/GSSG）检测后，脱颈处死取出脑组织进行免疫印迹法检测。

1.4 Garcia评分 按文献[12]报道方法进行评分，总分2～15 分，分数越高表示神经功能越好。首先，观察小鼠在笼子内自发活动5 min，评分标准为无活动（0分），有活动、仅有位置变化（1分），有活动但接触笼子四个边缘少于3 个（2 分），有活动、接触笼子四个边缘（3分）；其次，观察四肢活动左右对称性，一侧肢体无活动（0 分），一侧肢体轻度活动（1 分），一侧肢体活动缓慢（2分），双侧对称，与SAH前期无明显差别（3分）；第三，提起尾巴观察四肢活动左右对称性，一侧肢体无活动、肢体无外展（0分），一侧肢体轻微活动和外展（1 分），肢体有活动、比另一侧稍弱（2分），双侧肢体活动基本对称、与SAH 前无明显差异（3 分）；第四，观察爬网能力，不能攀爬（1 分），一侧肢体稍弱（2分），爬网能力正常、与SAH前无明显差异（3 分）；第五，触碰一侧身体反应评分，无反应（1分），一侧反应稍弱（2分），双侧对称（3分）。

1.5 平衡木实验评分 取平衡木器材，实验前小鼠在两边平板上分别放置10 s，然后把小鼠放在横木中间，观察40 s 移动情况：0～1 分，没有移动、跌落；2分，移动22 cm且停留置至少25 s；3分，移动超过22 cm 且停留至少25 s；4 分，到达平板或25 s 内走完一半的距离没爬上平板；5分，25 s内到达平板。

1.6 出血量评分 参照文献[12]报道方法进行出血量评分。将基底池分为6 段，每段根据血凝块数量分为0～3 级：0 级为无血凝块，1 级为极少血凝块，2 级为中度血凝块、但动脉可识别，3 级为掩盖该段内的所有动脉。SAH出血分级的最终评分为六个部位之和：0～7分为轻度出血，8～12分为中度出血，13～18为重度出血。排除评分小于8 分的小鼠，将中度和重度出血小鼠选为SAH模型。

1.7 干湿重法检测脑水含量 术后24 h 脊椎脱臼法处死小鼠，取脑组织称重（湿重），在100 ℃下烘干至脑组织重量不再改变（干重）。脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.8 外周血ROS 和MDA 含量检测 用毛细采血管采取小鼠眼球静脉血，4 ℃下10 000 转/min 离心10 min，抽取血清待测。用ROS 试剂盒和MDA 试剂盒按照说明书进行测定ROS和MDA。

1.9 GSH/GSSG 比值检测 选用标准GSH/GSSG 试剂盒按照说明书进行标准化操作。

1.10 免疫印迹法检测 小鼠脱颈处死后取出血侧脑组织，检测PKA、CREB、GCLC、p-PKA、p-CREB表达水平。先将脑组织研磨后加入RIPA裂解液，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，静置裂解30 min 后，4 ℃下12 000 转/min 离心10 min，取上清液待测。使用BCA 试剂盒进行定量，先将蛋白质样本进行电泳分离后，转移到PVDF 膜。BSA 封闭后，应用一抗和二抗孵育，使用BeyoECL 发光溶液进行曝光。β-actin为内参，使用Image J 软件进行灰度值分析。

1.11 统计学分析 应用GraphPad Prism v9.0 软件进行统计学分析；计量资料以±s表示，采用单因素方差分析；P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 C3G 对小鼠SAH 后神经功能的影响 与假手术组相比，SAH 组Garcia 评分和平衡木实验评分均明显降低（P＜0.05；图1）；C3G 明显增加Garcia 评分和平衡木实验评分（P＜0.05；图1），且以中剂量C3G 作用最明显（P＜0.05；图1）。因此，选取20 mg/kg 为最适剂量进行后续实验。

图1 C3G对小鼠SAH后神经功能的影响

2.2 C3G对小鼠SAH后脑含水量和出血量评分的影响 与假手术组相比，SAH 组脑含水量明显增加、出血量评分明显增高（P＜0.05；图2）。C3G明显减轻脑含水量、降低出血量评分（P＜0.05；图2）。

图2 C3G对小鼠SAH后脑含水量和出血量评分的影响

2.3 C3G对小鼠SAH后外周血氧化应激产物的影响与假手术组比较，SAH 组外周血ROS、MDA 含量明显增高（P＜0.05；图3），而GSH/GSSG 比值明显降低（P＜0.05；图3）。C3G 明显降低外周血ROS、MDA 含量（P＜0.05；图3），明显增加GSH/GSSG 比值（P＜0.05；图3）。

图3 C3G对小鼠SAH后外周血氧化应激产物的影响

2.4 C3G 对小鼠SAH 脑组织PKA/CREB 信号通路的影响 与假手术组比较，SAH 组p-PKA、p-CREB 和GCLC 表达水平明显降低（P＜0.05；图4），而PKA、CREB 表达水平无明显变化（P＞0.05；图4）。C3G 明显增加SAH 后脑组织p-PKA、p-CREB、GCLC 表达水平（P＜0.05；图4），而对PKA、CREB 表达水平无明显影响（P＞0.05；图4）。

3 讨论

本文结果显示，C3G 可能通过激活PKA 信号通路，减轻氧化应激损伤，改善小鼠SAH 后EBI。EBI为SAH后72 h内发生的一系列病理反应，为SAH死亡的主要原因[1，12]。EBI 损伤机制包括微循环衰竭、微血栓形成、离子稳态改变、兴奋性中毒、血脑屏障破坏、炎症和氧化级联反应、基质金属蛋白酶上调等，共同参与SAH后细胞死亡，最终功能障碍[1]。氧化应激损伤是其中至关重要的机制，发病72 h内，抗氧化成分的减少、脂质过氧化产物的急剧增加，与不良预后密切相关[1]。

抗氧化剂或者阻断氧化应激反应的药物有助于减轻氧化应激损伤。C3G是花青素家族中最常见的一种抗氧化性强的成分[14]。C3G可以减轻体外培养的神经元的氧化应激损伤，显著提高细胞活力和减少细胞凋亡[15]。研究发现C3G可能是通过保护线粒体GSH 发挥抗氧化应激的神经保护作用[16，17]。C3G也可能是由其他物质介导神经保护作用。首先C3G在生理pH值下不稳定，可以被降解成原儿茶酸和氰化物等物质，这两种代谢产物都能抑制H2O2诱导的线粒体功能障碍和DNA 片段化；其次，C3G 被吸收后，主要被结合到细胞膜上，因此，C3G 的作用还需要其他物质介导[17]。本实验结果显示，小鼠SAH 后脑水肿加剧，外周血ROS 和MDA 含量明显增加，神经功能严重受损；而C3G明显减轻脑水肿，降低ROS和MDA 水平，增加GSH、p-PKA 和p-CREB，GSH 生成的关键酶GCLC 也明显上调。这提示C3G可能是通过激活PKA 通路，上调GCLC，促进GSH 生成，减轻氧化应激损伤，从而发挥神经保护作用。

研究表明，减轻或抑制氧化应激，可减轻SAH后EBI[19]。SAH后，作为血液成分之一的氧合血红蛋白自身会产生ROS，线粒体和酶也会促进ROS 的生成，内源性抗氧化保护系统受到抑制，氧化应激显著加重[20]。哺乳动物依赖GSH的抗氧化系统在细胞防御活性氧的过程中起重要作用，cAMP/PKA 信号通路可以促进GSH 的生成。C3G 明显促进PKA 磷酸化，进而促进CREB 磷酸化，诱导GCLC 表达，促进GSH的生成，起抗氧化作用[21]。

本研究尚有不足之处。在SAH 模型制作中，每只小鼠的SAH 评分并不一致，这可能会影响小鼠的各类指标，目前缺少更严谨的评价指标。此外，EBI的发生机制十分复杂，还包括炎症反应等多种病理反应[22]，氧化应激的过程也是多种病理机制构成，涉及到多种因子之间的反应。本实验仅针对C3G对于ROS 和MDA 的变化进行验证，GSH/GSSG、p-PKA，p-CREB 和GCLC 的增加虽然提示了C3G 可能的作用通路，但C3G 是否与其它因子间存在相互作用尚不清楚。因此，C3G 对于EBI 是如何发挥作用的还需要进一步研究。

总之，C3G 能减轻小鼠SAH 后EBI，改善小鼠神经功能，其机制肯能是激活PKA 信号通路，上调GCLC 表达，抑制氧化应激反应，从而减轻氧化应激损伤。