银鲳消化道形态与组织学结构特征及其消化酶活性

唐道军 刘 洋 郑学斌 倪君杰 侯聪聪 王亚军 徐善良 张春丹 金 珊 徐万土 竺俊全*

(1. 宁波大学教育部应用海洋生物技术重点实验室, 宁波 315211; 2. 象山港湾水产苗种有限公司, 象山 315702)

消化道是鱼类摄食及消化吸收的主要场所, 研究鱼类消化道形态结构、黏液细胞的分布和密度及消化酶活性, 有助于了解鱼类摄食、消化吸收与结构之间的关系及探讨消化吸收的生理机制, 也有助于了解鱼类的营养需求, 选择合适的饲料原料,为饲料配方的设计提供参考[1]。目前, 国内外关于鱼类消化道的研究已有较多报道, 其中海水鱼类已见大黄鱼(Larimichthys crocea)[2]、小黄鱼(Larimichthys polyactis)[3]、日本海鲈(Lateolabrax japonicus)[4]、日本鬼鲉(Inimicus japonicus)[5]、大西洋白姑鱼(Argyrosomus regius)[6]、阿根廷鳀(Engraulis anchoita)[7]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[8]、平鲷(Rhabdosargus sarba)[9]和龙头鱼(Harpodon nehereus)[10]等种类中报道。

银鲳(Pampus argenteus)属鲈形目(Perciformes)、鲳科(Stromateidae), 是我国名特海产经济鱼类之一,海洋渔业的重要捕捞对象[11,12]。目前, 银鲳人工繁殖及养殖已取得成功, 其生物学研究备受重视, 如形态特征[13,14]、营养成分[15], 资源利用[16]、繁殖[17]、遗传多样性[18—20]、食性及摄食习性[11,21—23]等方面均已见报道。有关银鲳消化系统形态学研究已见仔鱼消化系统组织学[24]、幼鱼早期(2.61±1.05) g侧囊及肝脏超微结构的研究报道[25]。但对银鲳幼鱼后期消化道结构、黏液细胞分布及消化酶活性的研究尚未见详细报道。银鲳消化系统具有特殊的食道侧囊结构[25,26], 其消化吸收的生理机制可能与其他鱼类有所差异; 此外, 银鲳人工养殖群体的生长速度明显比自然海区野生群体慢, 适口饵料的开发是影响其生长的关键因素之一[27], 因此本研究采用解剖、石蜡切片、AB-PAS染色及酶活性检测技术, 对养殖银鲳消化道的形态、组织学结构、黏液细胞分布及消化酶活性进行研究, 旨在了解银鲳消化道形态结构特点及其功能, 为其消化生理机制的研究及养殖饲料配方的研制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

从浙江省象山港湾水产苗种有限公司室内人工养殖的银鲳中选取20尾, 其中10尾用于解剖观察及肠指数测量(其中6尾在观察及测量后, 取样用于后续消化酶活性检测), 5尾用于组织学观察, 5尾用于黏液细胞染色, 平均体长(13.28±1.64) cm, 体重(73.55±21.92) g, 暂养于水槽, 停食24h后供实验用。

1.2 方法

解剖观察活体解剖银鲳, 观察其消化系统组成及形态特征并拍照。测定体长、体质量和肠长, 计算肠指数(肠长/体长;n=10)。

组织切片与黏液细胞观察取舌、食道侧囊、食道、胃、幽门盲囊及肠道部分, 切成小段或小块, Bouin’s液固定24h, 酒精梯度浓度脱水、石蜡包埋、切片厚6—8 μm, HE染色, Olympus-BX53显微镜观察并摄像; 用图像分析软件Photoshop测定消化道各段黏膜皱褶的高度、黏膜下层厚度和肌层厚度等数值(n=5)。

取舌、食道侧囊、食道、胃、幽门盲囊及肠道组织, 制作常规石蜡切片, 爱先蓝-糖原(AB-PAS)染色法染色, 显微观察黏液细胞类型[28]。Ⅰ型呈红色, 含中性黏多糖, 爱先蓝(AB)反应阴性, 过碘酸-雪夫(PAS)反应阳性; Ⅱ型呈蓝色, 含酸性黏多糖,AB反应阳性, PAS反应阴性; Ⅲ型呈紫红色, 主要含有中性黏多糖及少量酸性黏多糖, AB与PAS反应均为阳性; Ⅳ型呈蓝紫色, 主要含有酸性黏多糖及少量中性黏多糖, AB与PAS反应均为阳性。取各组织3张切片进行显微观察, 每张切片随机选取6个视野观察统计黏液细胞数量, 以每一视野中500 μm×500 μm范围内黏液细胞个数为准(n=5)。

消化酶活性测定活体解剖6尾银鲳, 取肝胰脏、食道侧囊、胃、前肠、中肠及后肠组织, 于液氮中快速冷冻后置-80℃冰箱保存。测定消化酶活性时, 取6尾鱼的组织两两随机混合成3组, 按质量体积比1/4加入组织匀浆液匀浆, 4℃离心15min(2500 r/min)后取上清液, 用南京建成科技有限公司的酶活检测试剂盒检测消化酶(A080-2胰蛋白酶、A080-1胃蛋白酶、A054-1脂肪酶、C016-1 α-淀粉酶和A059-1碱性磷酸酶)及可溶性蛋白, 用酶标仪(Thermo, Multiskan GO 1510)和紫外分光光度计(SHIMADZU SPECTROPHOTOMETER UV-1800)测定吸光度, 实验重复3次。

在37℃、pH 8.0条件下, 1 mg蛋白中的胰蛋白酶每分钟吸光度值变化0.003为一个胰蛋白酶活力单位。在37℃条件下, 组织中每1 mg蛋白每分钟分解蛋白生成1 μg氨基酸为1个胃蛋白酶活力单位;在37℃条件下, 每1 mg组织蛋白在反应体系中与底物反应1min, 每消耗1 μmol底物为1个脂肪酶活力单位; 在37℃条件下, 组织中每1 mg蛋白与底物作用30min, 水解10 mg淀粉为1个淀粉酶活力单位; 在37℃条件下, 每1 mg组织蛋白与基质作用15min产生1 mg酚为1个碱性磷酸酶活力单位。

数据处理实验数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示, 采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 选择Post Hoc Multiple Comparisons: LSD, 并设置差异显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 消化道外形特征

银鲳消化道由口咽腔(舌)、食道侧囊、食道、胃及肠构成(图 1)。口咽腔后紧接食道侧囊, 食道侧囊膨大呈椭圆形, 表面墨黑。食道粗短, 胃呈U型。胃与肠相连处着生指状幽门盲囊。肠道有多个盘曲, 以前1/3及后1/3为界, 分为前、中、后肠。肠指数为2.03±0.44(n=10)。

图1 银鲳消化系统组成及消化道外形Fig. 1 The composition of digestive system and morphology of digestive tract in Pampus argenteus

2.2 消化道组织学结构特征

口咽腔(舌)舌由基舌骨前端突出部分外覆黏膜层组成(图 2A1)。黏膜层由复层扁平上皮及固有膜疏松结缔组织构成(图 2A2), 上皮层中分布有黏液细胞及味蕾, 味蕾由固有膜隆起形成的乳头状突起所支撑, 顶端有味孔开口于黏膜层表面(图 2 A3), 固有膜中含较多脂肪细胞(图 2A1)。

食道侧囊由黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层组成, 各层厚度显著高于消化道其余部分(表 1), 黏膜层、黏膜下层及纵肌层向腔内凹陷形成横膈层(图 2B1和B2)。黏膜层及黏膜下层共同向侧囊腔内突起形成皱襞, 皱襞的顶端及侧面可见次级突起, 由黏膜层包裹角质刺构成; 黏膜上皮为复层扁平上皮, 内含黏液细胞(图 2B5和B6)。黏膜下层中分布有较多脂肪细胞, 在黏膜下层及肌层中可见固定皱襞的骨质脚根; 肌层发达, 由内层环肌及外层纵肌构成, 纵肌层被结缔组织分隔成束状(图2B3和B4)。浆膜层薄, 由疏松结缔组织和间皮构成(图 2B1和B2)。

食道由黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层组成(图 2C1)。黏膜层及黏膜下层向食道腔内突起形成高的皱襞, 黏膜层上皮为复层扁平上皮, 内含少量黏液细胞, 上皮之下为固有膜结缔组织, 内可见血管分布(图 2C3和C4)。黏膜下层为结缔组织, 内含大量纵行的肌肉束; 肌层由内环肌和外纵肌构成; 浆膜层薄(图 2C2)。

胃由黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层组成(图 2D1)。胃内表面突起形成的皱襞发达, 被覆单层柱状上皮, 未见黏液细胞分布(图 2D1和D3)。上皮之下的固有膜结缔组织较厚, 内分布有大量胃腺, 每一腺体由腺细胞围成, 中央为腺腔(图 2 D3)。黏膜下层为结缔组织; 肌层由发达的内环肌及外纵肌构成, 系平滑肌; 浆膜层薄(图 2D1和D2)。

图2 银鲳舌、食道侧囊、食道及胃组织学结构Fig. 2 Histological observations of tongue, esophageal sac, esophagus and stomach in P. argenteus

幽门盲囊由黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层组成(图 3E1和E2)。黏膜层向腔内突起形成较多纵行皱襞, 形态似肠绒毛。黏膜层上皮为单层柱状上皮, 游离面具纹状缘, 上皮内分布有黏液细胞(图 3E3)。黏膜下层为薄层结缔组织; 肌层由内环肌与外纵肌构成, 环肌比纵肌厚, 但肌层厚度显著低于肠道(表 1); 浆膜层薄(图 3E2)。

肠肠由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层组成(图 3F1、G1和H1)。黏膜层向肠腔内突起形成许多皱襞, 即肠绒毛。黏膜层上皮为单层柱状上皮, 游离面具纹状缘, 上皮内分布有较多黏液细胞。上皮之下为固有膜结缔组织。黏膜下层较薄,由结缔组织构成, 内有血管分布。肌层发达, 内环肌层比外纵肌层厚。浆膜层薄(图 3F2、F3、G2、G3、H2、H3和H4)。黏膜皱襞高度前、中、后肠差异显著, 前肠高于后肠、后肠高于中肠。黏膜下层厚度前、中、后肠差异不显著。环肌层厚度前、中、后肠差异显著, 后肠高于前、中肠。纵肌层厚度前、中、后肠间差异较小(表 1)。

图3 银鲳幽门盲囊及前、中、后肠组织学结构Fig. 3 Histological observations of pyloric sac, anterior intestine, middle intestine and posterior intestine in P. argenteus

表1 银鲳消化道组织形态测量参数Tab. 1 Morphometric parameters of digestive tract tissues of P. argenteus (n=5)

2.3 消化道黏液细胞类型及分布

舌、食道侧囊及食道上皮内均可见Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型3种黏液细胞分布, 其中舌上皮内Ⅱ型及Ⅲ型黏液细胞密度稍高于Ⅳ型黏液细胞(图 4A和表 2), 食道侧囊上皮内Ⅳ型黏液细胞密度显著高于Ⅱ型及Ⅲ型黏液细胞(图 4B和表 2), 食道上皮内Ⅳ型黏液细胞密度最高(图 4C和表 2)。胃上皮内未观察到黏液细胞(图 4D)。

图4 银鲳舌、食道侧囊、食道及胃中黏液细胞分布Fig. 4 Distribution of mucinous cells in the tongue, esophageal sac, esophagus and stomach of P. argenteus

幽门盲囊上皮内可见Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型4种黏液细胞, 但分布较为分散, 密度较低(图 5E)。

前、中、后肠上皮内各型黏液细胞的总密度呈先上升后下降趋势(图 5F—H)。前肠上皮内Ⅰ型黏液细胞密度最高, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型黏液细胞也有一定密度。中肠及后肠上皮内Ⅰ型黏液细胞密度显著高于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型黏液细胞密度(图 5F—H和表 2)。

图5 银鲳幽门盲囊及前、中、后肠黏液细胞分布Fig. 5 Distribution of mucinous cells in the pyloric sac, anterior intestine, middle intestine and posterior intestine of P. argenteus

表2 银鲳消化道黏液细胞类型及分布密度Tab. 2 Type and distribution of mucous cells in digestive tract of Pampus argenteus (cell/mm2; n=5)

2.4 消化酶活性

胰蛋白酶肠道各段胰蛋白酶活性高于消化道其他各部, 后肠胰蛋白酶活性最高, 比活力(1817.848±60.905) U/mg prot, 其次为前肠, 比活力(1455.103±66.557) U/mg prot, 中肠酶活性显著低于前肠和后肠(P＜0.05), 但稍高于胃和肝胰脏。食道侧囊胰蛋白酶活性最低, 比活力(182.364±20.892) U/mg prot(图 6A)。

胃蛋白酶胃中胃蛋白酶活性最高, 比活力(16.350±1.547) U/mg prot。食道侧囊胃蛋白酶活性仅次于胃, 比活力(14.625±0.65) U/mg prot。肝胰脏中胃蛋白酶活性显著低于侧囊及胃(P＜0.05), 比活力为(7.578±2.131) U/mg prot; 肠中胃蛋白酶活性最低, 前肠胃蛋白酶比活力仅(1.745±0.05) U/mg prot,且与中肠及后肠无显著差异(P＞0.05; 图 6B)。

脂肪酶肠道中后肠脂肪酶活性最高, 比活力(25.666±1.816) U/g prot, 前肠脂肪酶活性次之,比活力(17.118±2.685) U/g prot, 中肠脂肪酶活性较低, 比活力(6.698±0.448) U/g prot。胃及肝胰脏中脂肪酶活性也较高, 比活力分别为(13.231±2.466)和(13.842±0.298) U/g prot; 侧囊中脂肪酶活性最低,比活力(2.003±1.75) U/g prot(图 6C)。

淀粉酶肠道中淀粉酶活性较高, 其中中肠最高, 比活力(247.33±22.88) U/g prot, 其次为前肠,比活力(207±22.885) U/g prot, 再次是后肠, 比活力(156.670±27.462) U/g prot。胃及肝胰脏中淀粉酶活性稍低于后肠。食道侧囊中淀粉酶活性最低, 比活力(40±13.221) U/g prot(图 6D)。

碱性磷酸酶肠道中碱性磷酸酶活性显著高于消化道其他各部, 其中前肠酶活性最高, 比活力(61.963±1.293) U/g prot, 其次是后肠, 比活力(54.806±1.139) U/g prot, 再次是中肠, 比活力(37.220±0.805) U/g prot。侧囊、胃及肝胰脏中酶活性显著低于肠道(P＜0.05), 其中以肝胰脏酶活性最低, 比活力为(0.182±0.004) U/g prot(图 6E)。

图6 银鲳肝胰脏、食道侧囊、胃及肠中消化酶活性Fig. 6 Digestive enzymes activities in liver pancreas, Esophageal sac and gastrointestine of P. argenteus

3 讨论

3.1 消化道各部的结构及消化酶活性与其功能的相关性

银鲳的舌黏膜上皮为较厚的复层扁平上皮, 具有较好的耐磨性。上皮内分布有较多Ⅱ型和Ⅳ型黏液细胞, 可在舌及口咽腔表面分泌酸性黏液物质,有助于润滑食物、防止机械或化学损伤及起保护或抑菌作用[29—31]。银鲳舌黏膜层中还分布有味蕾,在感受及甄别食物上发挥重要作用。

据研究, 银鲳食道侧囊内壁具有许多乳突, 上有刺状次级突起, 即角质刺[25]; 角质刺上还可再生三级小刺[24,32]。本研究发现, 银鲳食道侧囊皱襞发达, 皱襞顶端及侧面有内含角质刺的次级突起, 但并未发现三级小刺; 侧囊中角质刺的存在有利于对食物进行研磨, 减轻胃部食物消化分解压力。银鲳食道侧囊的黏膜层含Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型黏液细胞,Ⅲ型黏液细胞分泌的中性黏多糖有助于食物颗粒转化为食糜[7,30], Ⅱ型和Ⅳ型黏液细胞分泌的黏液物质中含有大量的水解酶等抗菌物质[33], 可有效防止病菌通过口咽腔侵入体内。银鲳食道侧囊胃蛋白酶活性较高, 可能在食物蛋白质初步消化中发挥作用。银鲳食道皱襞发达, 被覆复层扁平上皮, 内含Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型黏液细胞, 肌层也较发达, 这些特点与食道侧囊结构相似, 不同的是食道的初级突起上无次级突起及角质刺, 说明食道无食物的研磨功能, 而主要起到将食物推送入胃的作用。

银鲳的胃属U型, 较肠稍膨大, 与大黄鱼[2]、小黄鱼[3]、平鲷[9]及龙头鱼[10]等具有储存大量食物功能的卜型胃相比不算发达。银鲳胃内无黏液细胞,但分布有大量胃腺, 可分泌盐酸等强酸性物质, 为胃蛋白酶等酸性蛋白酶类提供良好的酸性环境, 促进食物的分解和营养物质的吸收。银鲳的胃中胃蛋白酶活性高, 胰蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性也有一定水平, 表明胃部在蛋白质、脂肪和淀粉等的消化方面发挥重要作用。

银鲳的幽门盲囊数达400—700条[26], 显著多于小黄鱼(11-13条)[3]、龙头鱼(18-23条)[10]等肉食性鱼类及鲻(Mugil cephalus; 2条)[34]等杂食性鱼类,而与翎鲳(Pampus punctatissimus; 600—700条)、灰鲳(Pampus cinereus; 600—650条)及中国鲳(Pampus chinensis; 600—700条)等鲳科鱼类较为接近[26]。

本研究显示, 银鲳幽门盲囊结构与肠类似, 由黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层组成, 黏膜层皱襞较发达, 内含Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型4种类型黏液细胞, 能分泌中性黏多糖及酸性黏多糖。这表明银鲳的幽门盲囊具有消化吸收功能, 增加了消化道的消化吸收面积[1]。

银鲳肠道内褶皱(肠绒毛)多, 其上皮层中含各型黏液细胞, 分泌的黏多糖可结合多种消化酶类,促进肠道对营养物质的消化吸收[35]。银鲳的肠道可分为前、中、后肠三段, 其中前肠的黏膜褶皱高且密集, 胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碱性磷酸酶活性均处于较高水平, 表明具有较强的消化吸收能力; 中肠的黏膜褶皱高度显著降低, 胰蛋白酶、脂肪酶等活性处较低水平, 但淀粉酶活性较高, 表明在淀粉类物质的消化吸收方面发挥一定作用。后肠的黏膜褶皱与前肠一样高且密集, 且胰蛋白酶、脂肪酶及碱性磷酸酶活性均处于较高水平, 该特点与小黄鱼[3]、大黄鱼[36]等海水鱼类的后肠黏膜褶皱高度较高且胰蛋白酶、脂肪酶及碱性磷酸酶活性较高的特点相似。后肠的肠绒毛高且密集, 可吸附并积累各种消化酶类, 有助于对食糜的进一步消化吸收[3,37]。从银鲳后肠高且密集的肠绒毛及较高的消化酶活性判断后肠也具有较强的消化吸收能力。银鲳肠道内的黏液细胞以Ⅰ型为主, 且肠道内中性黏液细胞所占比例由前往后逐渐增加, 据研究,I型黏液细胞分泌的中性黏多糖可与碱性磷酸酶相结合, 参与大分子物质的运输及糖类、脂质、无机盐等营养物质的吸收[30,38,39]。此外, 银鲳肠道内胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碱性磷酸酶活性总体较高, 表明肠道在蛋白质、脂质、糖类及无机盐等营养物质的消化或吸收方面均发挥重要作用。

3.2 消化道结构及消化酶活性与食性的相关性

银鲳消化道内蛋白酶活性较高, 符合肉食性鱼类特点; 但银鲳的胃不太发达, 肠指数较高(2.03±0.44), 明显大于小黄鱼(0.63)[3]、平鲷(0.48)[9]及龙头鱼(0.59)[10]等肉食性鱼类, 符合杂食性鱼类特点。Dadzie等[11]研究发现, 科威特海域银鲳主要摄食桡足类或其卵(39%)、硅藻(21%)、非桡足类甲壳动物(16%)及软体动物(11%)等; 彭士明等[21]研究认为, 箭虫可能是渤海银鲳的主要食物来源(占57%), 其次为虾类(11.8%)、头足类(8.4%)和水母类(7.1%)等; 魏秀锦等[23]研究认为渤海银鲳主要摄食底层虾类(62.90%)、日本枪乌贼(Loligo japonica)(23.29%)和浮游植物(8.08%)等, 可见银鲳为偏肉食的杂食性鱼类。我们在养殖过程中观察发现, 银鲳并非一次性大量摄食、行缓慢消化, 而是少量多次摄食, 消化周期较长, 此种摄食习性与其具食道侧囊、胃不发达、幽门盲囊数量多和肠指数较高等相关。银鲳消化道内蛋白酶活性较高, 脂肪酶、淀粉酶及碱性磷酸酶活性也有一定水平, 因此银鲳配合饲料的设计, 除了应保证较高的蛋白质含量外,还应适当添加脂肪、淀粉及无机盐类等物质, 以确保其营养平衡。

4 结论

银鲳的胃不发达, 幽门盲囊数量多, 肠指数较高(2.03); 口咽腔及食道间具有特殊的侧囊结构, 起到研磨食物及初步消化蛋白质的作用; 胃中含有大量胃腺, 主要行蛋白质的消化吸收功能; 肠道内分布较多I型黏液细胞, 分泌的中性黏多糖可促进消化吸收进程; 肠道内胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碱性磷酸酶均处于较高水平, 在蛋白质、脂质、糖类及无机盐离子的消化或吸收方面均发挥重要作用。银鲳的消化道结构特点、黏液细胞分布及消化酶活性与其功能及偏肉食的杂食性相适应。