金雀异黄素对三硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠的干预作用及其可能机制▲

张怡华 吕晓丹 曾睿智 韩 冰 张维维 徐小芳 陈如艳 叶卫政 陈晓战 范俊华 詹灵凌 吕小平

(广西医科大学第一附属医院1 消化内科，2 检验科， 南宁市 530021，电子邮箱：624785938@qq.com)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)以胃肠道不受控制的慢性炎症为特征，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其患病率逐年增加[1]。IBD的病因尚未完全明确，其与遗传、免疫功能紊乱、肠道菌群失调、肠道屏障受损及环境等因素均有密切的关系，已成为全球性的健康问题[2-3]。目前治疗IBD的药物主要有5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂，这三类药物对溃疡性结肠炎或克罗恩病有一定的治疗效果，但都有其各自的局限性及不良反应[4]。

金雀异黄素(genistein，GEN)是一种大豆中天然存在的异黄酮类物质，化学名为4′,5,7-三羟基异黄酮，不溶于水，但可溶于常用的有机溶剂。有研究表明，GEN有多种生物学作用，包括抗氧化、抗炎和抗癌[5-6]。还有研究表明GEN能显著降低白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6的表达水平，且能显著抑制HCT116细胞系中的核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的核转位，以及核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor κB,IκB)和核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor κB kinase,IKK)α/β的磷酸化[7]，而NF-κB信号通路在炎症、适应性免疫反应中起着重要的调节作用[8]。p65是NF-κB家族成员之一，其一般以二聚体的形式存在。在未受到刺激时，这种二聚体被IκB-α隔离在胞质中；受到刺激时，IκB-α被磷酸化和降解，使游离的二聚体进入细胞核内，进而激活靶基因的转录，促进炎症的发生、发展[9-10]。由此可见，GEN可能可通过调节NF-κB信号通路参与炎症反应。本研究旨在探讨GEN对三硝基苯磺酸(trinitro-benzene sulfonic acid，TNBS)诱导的结肠炎小鼠模型的干预作用，并基于NF-κB 信号通路探讨其作用机制，旨在为治疗IBD的新药研发提供理论依据和实验参数。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周龄，体重为20～22 g，购于北京维通利华实验动物中心(许可证号:SCXK 京2021-0011)。在无特定病原体级动物房里饲养，环境相对湿度为60%，温度为24℃。给予所有小鼠自由进食、饮水1周后用于实验。按随机数字表法将小鼠分为正常对照组、模型组、柳氮磺砒啶组、GEN组，每组8只，并用耳标做好标记分别饲养。

1.2 主要试剂 GEN(批号：A2198)由APExBIO公司生产；TNBS(批号：P2297)由Sigma-Aldrich公司生产；柳氮磺砒啶由上海信宜天平药业有限公司生产；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α；批号：EM0183)、IL-1β(批号：EM0109)、IL-10(批号：EM0100)ELISA试剂盒由武汉菲恩生物科技有限公司生产；兔单抗NF-κBp65抗体由Abcam公司生产；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体由Abcam公司生产(批号：ab181602)；兔单抗IκB抗体由Abmart公司生产；蛋白酶抑制剂(批号：A8260)、RIPA裂解液(批号：R0010)；洗膜缓冲液(TBST,批号：1085)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)、聚偏氟乙烯膜(批号：ISEQ00010)均由Solarbio公司生产。

1.3 构建TNBS诱导的结肠炎小鼠模型与药物干预 参照相关文献[11-12]的方法进行造模：所有小鼠于造模前1 d禁食不禁水，正常对照组给予生理盐水(4 mL/kg)灌肠，其余3组给予2.5%的TNBS溶液(4 mL/kg)灌肠。建模后第2天若小鼠出现明显的体重下降，大便性状改变或血便，则可以初步确定小鼠造模成功，随后在镜下观察小鼠结肠病理切片进一步确定。确定造模成功后再进行干预。造模第2天，给予正常对照组、模型组生理盐水(8 mL/kg)灌胃，对柳氮磺砒啶组小鼠用柳氮磺砒啶(450 mg/kg)(柳氮磺砒啶用生理盐水溶解)灌胃，GEN组小鼠用 GEN(20 mg/kg)灌胃，药物的灌胃剂量参照相关文献[13-14]及预实验结果,均为1次/d，连续给药7 d。实验期间若有小鼠建模不成功或死亡，则进行等量补充。

1.4 评估小鼠的疾病活动指数 于造模后第2天开始至给药结束，参照相关标准[15]，评估各组小鼠的疾病活动指数(disease activity index，DAI)，最后取7 d的平均值作为小鼠的DAI,评分标准见表1。

表1 DAI评分表

1.5 获取标本 连续给药7 d后采用颈椎脱臼法处死小鼠。眼眶采取800～1 000 μL血液，静置至第2天，4℃环境下3 000 r/min离心10 min后取上层血清用于检测炎症因子水平；分离结肠组织，观察大体形态后，将部分结肠用4%多聚甲醛固定，其余结肠组织放于-80℃冰箱中保存。

1.6 评估结肠形态 取近肛门端直肠至盲肠的结肠段，测量长度，剖开清理后观察并测量溃疡的大小，评估结肠大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index，CMDI)[16]，CMDI 评分标准见表2。

表2 CMDI评分标准

1.7 观察结肠病理变化 取近端肛门处结肠组织进行石蜡包埋、制作切片、HE染色，然后在显微镜下观察结肠组织的病理变化。

1.8 相关指标检测

1.8.1 血清炎症因子水平：取离心后的血清，根据试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-10、TNF-α 水平。使用iMark型全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)测定450 nm 波长处各孔的光密度值。以标准品的光密度值，绘制标准曲线，通过标准曲线计算标本各指标的浓度。

1.8.2 结肠组织IκB-α和p65蛋白表达水平：采用蛋白免疫印迹法检测结肠组织中IκB-α和p65的蛋白表达水平。随机取30 mg的结肠组织用冷PBS冲洗2～3次后置于匀浆管中。加入2个2 mm磁珠、300 μL含蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液的混合液后，置于研磨仪(武汉赛维尔科技有限公司)进行研磨。研磨结束后放置冰上静置30 min，吸取上清，利用RF-5301PC型分光光度计(日本岛津公司)上检测蛋白样品浓度。然后将5×蛋白上样缓冲液与蛋白样品按照4 ∶1混匀后，再进行沸水浴10 min。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶用 120 V，浓缩胶电压75 V)后进行1 h的转膜，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(200 mA)上，用 TBST洗膜3次(10 min/次)。5%脱脂牛奶封闭 1 h，用 TBST洗膜3次(10 min/次)，4℃孵育一抗(稀释比例为1 ∶20 000)过夜。第2天用TBST洗膜3次(10 min/次)，室温下孵育二抗(稀释比例为1 ∶10 000)1 h后，用TBST洗膜3次(10 min/次)。然后用Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)进行扫膜，再利用ImageJ软件分析目的条带灰度值。以GAPDH为内参，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带的灰度值/内参蛋白条带的灰度值。

1.9 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠的一般情况和DAI的比较 造模后第2天，除正常对照组外，其他组小鼠开始出现大便异常，体重下降；但柳氮磺砒啶组和GEN组小鼠经过灌胃相应的药物后，大便性状、便血及体重下降情况均较模型组有所改善。模型组、柳氮磺砒啶组的DAI高于正常对照组，而柳氮磺砒啶组和GEN组的DAI均低于模型组(均P<0.05)，但GEN组与柳氮磺砒啶组的DAI差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.2 各组小鼠的结肠长度和CMDI的比较 与正常对照组相比，其余3组小鼠的结肠均缩短，且出现不同程度溃疡和炎症等结肠损伤表现，CMDI升高(均P<0.05)；而与模型组相比，GEN组与柳氮磺砒啶组小鼠的结肠长度增加，CMDI降低(均P<0.05)；但GEN组与柳氮磺砒啶组小鼠的结肠长度和CMDI比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组小鼠DAI 、结肠长度和CMDI的比较(x±s)

2.3 各组小鼠的结肠病理变化 正常对照组小鼠的结肠组织形态正常，而模型组小鼠的结肠组织中炎症细胞浸润明显，程度较重，进一步证实建模成功；柳氮磺砒啶组和GEN组小鼠的结肠组织虽有炎症细胞浸润，但程度较模型组减轻。见图1。

图1 各组小鼠结肠组织病理改变(HE染色，×100)

2.4 各组小鼠的血清炎症因子水平的比较 与正常对照组比较，模型组和柳氮磺砒啶组血清TNF-α水平升高，3组血清IL-1β水平均升高，模型组血清IL-10水平降低，而柳氮磺砒啶组和GEN组血清IL-10水平升高(均P<0.05)。与模型组比较，柳氮磺砒啶组和GEN组血清TNF-α与IL-1β水平降低，而血清IL-10水平升高(均P<0.05)。与柳氮磺砒啶组相比，GEN组血清IL-1β水平降低而血清IL-10水平升高(均P<0.05)，但两组血清TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 4组小鼠血清炎症因子水平的比较(x±s，ng/mL)

2.5 各组小鼠结肠组织中IκB-α蛋白与p65蛋白相对表达量的比较 模型组的IκB-α蛋白与p65蛋白相对表达量均高于其余各组(均P<0.05)；柳氮磺砒啶组和GEN组的IκB-α蛋白、p65蛋白相对表达量与正常对照组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)；GEN组的p65蛋白相对表达量高于柳氮磺砒啶组(P<0.05)，但两组的IκB-α蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表5和图2。

表5 4组小鼠结肠组织中IκB-α蛋白与p65蛋白相对表达量的比较(x±s)

图2 4组小鼠结肠组织中IκB-α蛋白和p65蛋白的表达情况

3 讨 论

IBD是一组病因未明的慢性肠道炎症性疾病，可能与遗传、生物等因素有关，因患病率逐年升高，其已成为全球常见的消化系统疾病[17]。目前，治疗IBD的常见药物之一为生物制剂。不可否认，生物制剂具有疗效好、起效快等优点，但由于价格、免疫原性及长期应用的疗效和安全性等原因使其难以成为IBD患者的最优选择[18-20]。另外，对于一部分患者而言，生物制剂的治疗效果并不理想，需要寻找更佳的治疗药物。GEN是一类植物雌激素，为大豆的主要成分，在豆类食品中含量丰富，被人体摄取后主要以糖苷的形式存在[21]，具有酪氨酸激酶抑制剂活性，参与多种生物过程，可发挥抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种作用[22-23]。在东方的饮食结构中，大豆是不可或缺的食物，亚洲人群的豆制品食用量高于欧美各国人群[24]，《中国居民膳食指南(2019)》[25]也建议每人每天应摄取30～50 g大豆或相当量的豆制品，而食用大豆可增加GEN的摄入量[26]。这为我们开展GEN治疗IBD的作用机制研究提供了现实依据，且GEN治疗IBD在国外是研究热点之一，这说明GEN具有潜在的研究价值。

本研究结果显示，建模后模型组结肠炎小鼠出现体重下降，排血便或无便，结肠缩短，且DAI和CMDI均升高(均P<0.05)，提示结肠炎小鼠模型建模成功；与模型组相比，GEN组小鼠的大便性状、便血及体重下降等情况均有所改善，结肠长度增加，DAI和CMDI均降低(均P<0.05)。这提示GEN可以减轻结肠炎小鼠的疾病活动程度，缓解溃疡和炎症等结肠损伤情况，有效改善结肠炎小鼠的症状。此外，模型组小鼠肠壁炎症细胞的浸润程度显著增加，血清中促炎因子IL-1β、TNF-α水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低(均P<0.05)；GEN组小鼠肠壁炎症细胞浸润情况较模型组减轻，且促炎因子水平降低，抗炎因子水平升高(均P<0.05)。这表明GEN对TNBS所致的结肠炎小鼠具有一定的抗炎作用。而与柳氮磺砒啶组相比，GEN组促炎因子IL-1β水平更低，抗炎因子IL-10水平更高(均P<0.05)，这提示GEN具有更优的抗炎作用。虽然GEN组的DAI和CMDI高于柳氮磺砒啶组，但差异并无统计学意义(均P>0.05)，这可能与样本量较小、观察时间较短等因素有关。

NF-κB信号通路是调节炎症的关键通路，位于胞质中无活性的NF-κB可经TNF-α、IL-1等多种刺激因子诱导而被激活。NF-κB通路被激活后，IκB被IKK磷酸化，磷酸化后的IκB 被26S蛋白酶小体降解，进而使NF-κB被释放进入细胞核进行转录，促进与炎症相关的组织损伤的发生[27]。有研究表明，NF-κB信号通路在促进炎症的发展中起重要作用，其在结肠炎小鼠结肠黏膜中的表达升高[28]。还有研究表明，激活NF-κB的复合物主要成分为p65蛋白，当NF-κB活性增强时，p65蛋白的水平上调，从而促进肠道炎症的发展[29-30]。因此，本研究通过检测结肠组织IκB-α和p65蛋白的相对表达情况，了解GEN对结肠炎的干预作用是否与NF-κB信号通路有关。结果显示，模型组小鼠结肠组织中 IκB-α蛋白和p65蛋白的相对表达量升高，而GEN组小鼠结肠组织中 IκB-α蛋白及p65蛋白的相对表达量均低于模型组(均P<0.05)。这表明GEN能够下调IκB-α和p65蛋白的表达水平，从而抑制NF-κB信号通路的激活。由此推测，GEN对TNBS诱导的结肠炎小鼠的干预作用，可能与其抑制了NF-κB信号通路的活性，从而发挥抗炎作用有关[31]。

综上所述，GEN能够抑制TNBS诱导的结肠炎小鼠的炎症反应从而缓解症状，作用机制可能与其抑制NF-κB信号通路有关，其或可成为治疗IBD的潜在药物。本研究存在以下不足：GEN对TNBS所致结肠炎小鼠的抗炎作用的具体机制还未完全了解，尤其在基因层次的研究尚有不足，也无法得知GEN是否还通过其他信号通路发挥其抗炎的作用，此外GEN用于治疗结肠炎可能会产生的副作用也尚未完全清楚。因此，今后还需深入研究探讨GEN治疗结肠炎的疗效、确切作用机制和安全性。