水稻耐冷基因OsICE1 的克隆与转基因香菇菌丝体的创制

王红运,刘禹夫，于晓明，杨祥波，曲一格，张振宇，王晓航*

（1 吉林农业科技学院 农学院，吉林 吉林 132101；2 吉林省种子管理总站，长春 130000）

香菇隶属于真菌界 （Fungi）、 担子菌门（Basidiomycota），学名Lentinula edodes，是世界久负盛名的珍贵食用菌［1］。 香菇味道好，营养价值极高［2］。 同时还可作药用：有扶正补虚，健脾开胃，祛风透疹，化痰理气，解毒，抗癌等功效。别名又为香蕈。 目前香菇的研究多为香菇多糖对人体心血管的影响， 香菇中微量元素的分析等等， 还未有太多关于香菇分子生物学方面的研究［3］。 所以对香菇进行遗传转化研究尤为重要。本研究选用的为农杆菌介导法对香菇进行遗传转化，农杆菌介导法能在自然条件下趋化性的将TDNA 插入到植物基因组中，它转化率高，单拷贝比例高， 且转化子稳定。 是近年来常用的转化方法。 OsICE1 基因是水稻中的一种冷调控关键蛋白， 在多个文献中对于OsICE1 的抗冷性多有研究，具有比较稳定且作用明显的抗寒功能，在水稻受到低温时进行表达， 可以使水稻在一定程度上耐冷［4］。由此选用OsICE1 基因对香菇菌丝体进行遗传转化［5］，使得到带有OsICE1 基因的香菇菌丝体， 为实现香菇在寒冷条件大面积种植提供了重要依据与材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 香菇菌株由周玉麟食用菌研究所购入； 大肠杆菌DH5α 感受态、 根癌农杆菌EHA105 感受态保存在吉林农业科技学院农学院实验室， 日本晴水稻种子，pCsV1300 质粒保存于吉林农业科技学院农学院实验室， 质粒图谱见图1。

图1 pCsV1300 载体的T－DNA

1.1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒由生工股份有限公司购入，PCR、反转录试剂盒均购于全式金公司。

1.2 构建抗寒基因OsICE1 的基因表达载体

1.2.1 水稻发芽 首先挑选饱满的日本晴水稻种子， 把其放入处理好的培养皿中， 用生汞进行消毒，消毒15 min，把消毒后的种子在纱布上进行冲洗，把冲洗后的种子重新放回培养皿中，把培养皿上下两层分别平铺已经用超纯水沾湿的滤纸，把消毒后的种子放在下层滤纸上， 再把上层带有沾湿滤纸的培养皿盖住， 放入25 ℃无光的条件下进行培养［6］。 注意时常观察滤纸上的水分，始终保持滤纸湿润， 培养5 d 出现水稻根和芽。

1.2.2 水稻RNA 提取 对1.2.1 中培养的水稻种子的芽进行RNA 提取： 选用1.2.1 中的水稻芽0.2 g，用Trizol 法进行提取。

1.2.3 反转录体系 纯化RNA 以去除基因组DNA［7］， 操作按全式金公司的TransScript One-Step gRNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 说明书进行。 其体系见表1。

表1 反转录体系

条件为：PCR 42 ℃孵育30 min。 85 ℃加热5 s 失活TransScript RT／RI Enzyme Mix 和gDNA Remover。

1.2.4 OsICE1 目的基因的克隆 用primer 软件设计出的引物如下。

OsICE1 的引物序列：

OsICE1-clone-F: 5' ATGCTGCCGCGGTTTCA 3'OsICE1-clone-R: 5' CTAGATCATGGTATGGAAC CCG 3'

OsICE1-clone-XbaI-F:5' TGCTCTAGAATGCTGC CGCGGTTTCA 3'

OsICE1-clone-EcoRI-R: 5' CCGGAATTCCTAGAT CATGGTATGGAACCCG 3'

由吉林省库美生物科技有限公司合成。

PCR 扩增制备水稻全基因， 操作如下：PCR反应体系见表2。

表2 PCR 反应体系

PCR 反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，58 ℃退火32 s，72 ℃延伸45 s，循环30 次；72 ℃延伸5 min。 1%琼脂糖凝胶电泳。

PCR 扩增OsICE1 片段。 上一步扩增出来的水稻cDNA 全长作为模板， 用OsICE1-clone-XbaI-F，OsICE1-clone-EcoRI-R，引物，进行PCR扩增，反应条件同上面一样。

1.2.5 PCR 产物回收 将1.2.4 扩增出来的产物用Coolaber 公司的试剂盒对PCR 产物进行回收，获取所需要的目的基因片段。

1.2.6 双酶切 pCsV1300 质粒， 用EcoRI，XBaI进行酶切,反应体系见表3。

表3 酶切反应体系

在灭菌的0.2 mL 离心管中配制如下溶液（50 μL）：

37 ℃反应15 min， 所得产物保存于-4 ℃冰箱备用。 电泳。

选1.2.5 中回收的目的基因OsICE1 片段，用EcoRI，XBaI 进行酶切，反应体系见表4。

表4 酶切反应体系

37 ℃反应15 min， 所得产物保存于-4 ℃冰箱备用。 电泳。

1.2.7 DNA 连接 将1.2.6 中的两次酶切产物作为模板，用DNA 连接酶进行连接，体系见表5。

表5 酶连接反应体系

在灭菌的0.2 mL 离心管中配制如下溶液（15 μL）：

1.3 构建含有OsICE1 基因的DH5α

1.3.1 大肠杆菌的转化 连接产物转化E.coliDH5α。

1.3.2 转化子的筛选及鉴定 选取单菌落接种到含有AMP 的液体培养基中［8］，进行培养，鉴定。

1.4 农杆菌转化培养

1.4.1 农杆菌的转化 农杆菌EHA105 （含质粒pCsV1300） 划线于含有 （20 mg／L Rif，50 mg／L Kan）的LB 平板上,28 ℃培养2 d；单菌落在液体培养基中以28 ℃，200 r／min 培养2 d，用打孔器从培养6 d 左右的PDA 平板取菌丝块［9］，浸入农杆菌菌液中，侵染20 min。置于含有200 μmol／L AS 的共培养基上，25 ℃共培养2 d。 将培养后的菌丝块转接到筛选培养基中 （10 mg／L 潮霉素）筛选转化子， 培养2 周后取菌块周围新长出的菌丝进行复筛（12 mg／L 潮霉素培养基）。

1.4.2 抗寒性能试验测试 把复筛过的菌丝进行试管培养， 在黑暗、pH 为适宜的情况下， 分别在10 ℃、25 ℃的恒温培养箱进行培养， 分别在12 h、48 h、72 h 进行观察。

2 结果与分析

2.1 RNA 完整性分析

对发芽5 d 水稻进行冷胁迫（4 ℃）1 h，提取芽组织的RNA［10］。 结果如图2 显示，获得RNA 中28S 条带显著亮于18S，5S RNA 条带最弱， 说明提取的水稻RNA 具有较好的完整性。图2 的三条泳道均为发芽5 天后进行冷胁迫的水稻芽的RNA。

图2 发芽5 d 提取的水稻RNA

2.2 OsICE1 基因的获得

通过对水稻全基因组进行体外扩增［11］，并用特定引物进行PCR 后得到OsICE1 基因目的片段，它克隆获得到2 个阳性，如图3，1、3 泳道为获得的阳性克隆，测序结果显示为1627bp。

图3 水稻芽中OsICE1 基因的克隆

2.3 pCsV1300－OsICE1 表达载体的构建

pCsV1300 经过XBaI 与EcoRI 酶切后是9755bp 片 段 长，OsICE1 基 因 为1627bp 片 段 长。如图4 所示， 可以清楚地看到在2 条泳道上的两条DNA 条带。

图4 pCsV1300－OsICE1 表达载体

2.4 转基因香菇菌丝的鉴定

从 转 基 因 香 菇 菌 丝 体 中 提 取DNA［12］，用OsICE1-clone-F，OsICE1-clone-R 引物对提取出来的香菇DNA 进行体外扩增， 电泳图如图5 所示。图中第2 条泳道为阴性对照，第3、4 条泳道为用OsICE1-clone-F，OsICE1-clone-R 引 物PCR得到的产物，其大小在2000bp 左右。

图5 转基因香菇菌丝的鉴定

2.5 抗寒性试验的测试

香菇菌丝在25 ℃为最适生长温度， 试验主要做出了带有OsICE1 基因表达载体的香菇菌丝体与不带有OsICE1 基因表达载体的香菇菌丝体［13］，把他们分别放入了10 ℃和最适温度25 ℃。 可以看出，在25 ℃的温度，其余条件都相同的情况下他们长势大致相同。 而在10 ℃的温度，其余条件都相同的情况下， 带有OsICE1 基因表达载体的香菇菌丝体长势要比不带有OsICE1 基因表达载体的香菇菌丝体长势强， 但是明显比25 ℃情况下的菌丝长势弱。 由此可见，带有OsICE1 基因的香菇菌丝体可以在一定程度上抗寒， 比正常的香菇菌丝体长势好。

3 结论

香菇是一种重要的食用菌， 温度是影响香菇菌丝生长的重要因素， 每年有大面积的香菇遭受到寒冷温度的威胁，导致其产量下降［14］。 OsICE1是水稻中的一种冷调控关键蛋白， 在水稻抗寒种质创制中具有重要作用。 通过对水稻耐冷基因OsICE1 的克隆， 构建了pCsV1300-OsICE1 表达载体。完成了对香菇菌丝体的转化。抗寒性试验的测试可以看出，在10 ℃的温度，其余条件都相同的情况下， 有OsICE1 基因的香菇菌丝体比不带有OsICE1 基因的香菇菌丝体长势好。 由此可见，水稻耐冷基因OsICE1 的克隆与转基因香菇菌丝体的创制的可行性［15］。