铁皮石斛瓶苗的增殖生根和瓶内开花初探

范华雨，李慧敏，朱旭东，王鹏凯，韦庆华

（苏州农业职业技术学院，江苏苏州 215008）

铁皮石斛又叫黑节草、铁皮斗，是兰科草本植物。茎直立，圆柱形，属补益药中的补阴药，具有益胃生津、滋阴清热、润肺益肾、明目强腰、降血糖、增强机体免疫力等功效[1-2]。铁皮石斛常见的繁殖方法主要有离体快繁和分株扦插。离体快繁是利用石斛生长点组织，消毒之后将其接入提供生长繁殖所需的培养基里，放入特定的温光环境，进行无菌培养的过程，实现植物组织快速繁殖，提高农业生产力，增加经济收益[3-4]。近年来，关于铁皮石斛组织培养及快速繁殖的研究颇多，用于外植体的有种子、无菌苗幼苗茎段、原球茎及人工种子等[5-6]。而增殖分化与培养基的选择有不同的结论，需要作进一步验证。

铁皮石斛组培苗可在培养容器内开花。植物的瓶内开花受许多因素控制，如植物激素含量、外植体大小和培养条件，如培养的温度、光照、培养基的pH 值和糖含量等[7]。探究铁皮石斛瓶内开花，一可用作组培微景观材料，二可提供研究所需的种子资源材料，三可用来进行杂交选育新品种，四可探究影响瓶苗开花的原因，提高快繁商品苗的生产效率。李茹等[8-9]研究发现，培养基中添加适量的外源腐胺和精胺，可提高开花率，在培养基中添加不同浓度的多效唑后，铁皮石斛组培苗开花率均显著提高。李茹等[7]发现，以LED 光质中的红+蓝+绿光复合照射铁皮石斛组培苗，有利于其在瓶内开花，且花期早，开花率高。王兆春等[10]发现低温刺激和干旱胁迫可诱导石斛组培苗开花。可见，要想提高瓶内开花数还需要从多方面考虑。

为此，本研究设置不同培养基的配方，采取单因素试验分析方法，研究不同培养基配方对铁皮石斛瓶苗增殖生根和瓶内开花进程的影响，以期寻找适宜铁皮石斛瓶苗快速生长和瓶内开花的最佳配方。

1 材料与方法

1.1 材料

试验设在江苏省苏州市苏州农业职业技术学院相城科技园综合示范基地组培实验室进行，铁皮石斛瓶苗来源于本组培室自有保存种质。

1.2 试验方法

1.2.1 增殖培养。挑选无菌、长势一致的铁皮石斛瓶苗待用。进入实验室前先进行初步消毒，经过风淋室再次进行全身消毒。然后进入无菌操作实验室，换上无菌工作服，进行实验操作。首先，用配置好的新洁尔灭溶液进行手部消毒，然后用镊子夹取酒精棉，擦拭超净工作台进一步消毒。铁皮石斛为丛生苗，为了更好观察统计瓶苗增殖生根生长状态，接种时把丛生的铁皮石斛苗分切成单株苗。将初代形成的丛生芽分别转接到不同的继代培养基（表1）内进行进一步培养，每瓶接4 株苗，进行增殖培养，每种培养基接种30 瓶。增殖系数（%）=增殖完成后植株数/接种植株总数。

1.2.2 生根培养。将继代培养好的芽切出，分别转接到不同的生根培养基内（表1），进行生根培养，计算生根率。生根率（%）=（生根苗数/接种总数）×100。

1.2.3 开花培养。在前期研究的基础上，探究不同激素含量的培养基对铁皮石斛增殖生根和后续开花的影响。统计了6 种不同的增殖和生根培养基接种后的开花进程（表1），进行铁皮石斛瓶内开花的探究。30d 统计一次生长开花情况，60d 后测定开花指标。主要测定开花株数、花期，计算开花率，开花率（%）=开花株数（株）/接种有效株数（株）×100。

表1 组织培养研究使用培养基配方

保持温度在24～26℃，湿度在55%～60%，光强设置为30μmol/m2·s，光周期为12h/d，培养周期为60d。

1.3 统计分析

采用office2019 进行数据处理和分析，其中显著性差异采用SPSS16.0 系统中的Duncan 法进行检测。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对铁皮石斛增殖的影响

由表2 可知，P6培养的瓶苗增殖率最高，其次为P5，再者为P1；三者均显著高于其他3 个，分别较P3高43.64%、25.00%和12.94%，分别较P2高50.57%、31.03%和18.39%，分别较P4高65.82%、44.30%和30.37%。可以看出，在保持6-BA 和ABA 的含量相同的情况下，改变NAA 的含量，NAA 含量越低增殖系数越高；在保持6-BA 和NAA 的含量相同的情况下，改变ABA 的含量，ABA 含量越高增殖系数越高。可见，BA 1.0+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L 为铁皮石斛最佳增殖培养基配方。

表2 不同培养基对铁皮石斛增殖的影响

2.2 不同培养基对铁皮石斛生根的影响

由表3 可知，P10下瓶苗的生根率最高，其次为P9；二者显著高于其他2 个，分别较P8高51.78%和43.01%，分别较P7高57.01%和47.94%，但是二者之间无显著差别。可见，P10为铁皮石斛最佳生根率配方。

表3 不同培养基对铁皮石斛生根的影响

2.3 不同培养基配方对瓶内开花的影响

由表4 可知，P1下铁皮石斛的开花株数在接种30d 和60d 都是最高，其次为P10，二者显著高于其他处理。从接种30d 和60d 后，看到在接种前期开花进程较慢，随着培养时间的增加，开花数目增加较快。可见，P1显著促进了铁皮石斛的开花进程。

表4 不同培养基接种后的开花进程

图1 不同培养时间下铁皮石斛开花情况

由表5 可知，P1下铁皮石斛的每株开花数最高，显著高于其他处理，其次为P10，P9下最低；花期也是在P1下最大，显著高于其他处理，其次为P10，P5下最小；开花率在P1下达到最高，其次为P10，二者显著高于其他处理，P8下最小。可见，P1为铁皮石斛最佳开花培养基配方。

表5 不同培养基对开花的影响

3 结论与讨论

本研究设置不同的激素配比，探究不同培养基配方对铁皮石斛瓶苗的增殖生根和瓶内开花的影响。结果表明：较适合铁皮石斛瓶苗的增殖培养基配方为6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L，适合的生根培养基配方为1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L，适合瓶苗瓶内开花的培养基配方为6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ABA 1.0mg/L。研究也发现，1/2MS 的培养基以及添加了IBA 的培养基容易导致瓶苗产生玻璃化现象，苗体普遍发黄，但能够促使瓶苗生根。

通过对比发现，铁皮石斛大部分开花在接种2 个月后，可能此时培养基中的成分大部分被消耗，瓶苗可能出于自我保护进行开花。因此，可以判断营养元素的含量是导致铁皮石斛开花的原因之一。

本研究还发现，用于增殖的6-B 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L 培养基，铁皮石斛瓶苗也会开花，但开花周期至少得2 个月及以上，且花芽分化速度比较慢。此外，根据上述结果可以初步看出，第1 个月增殖效果好的培养基，开花效果不太明显，而开花效果暂时明显的，增殖效果不明显。铁皮石斛开花趋势呈曲线，以1 个月为分界，第1 个月呈现缓慢上升，到第2 个月呈现急速上升趋势；2 个月之后，开花趋势会随瓶内培养基的营养成分消耗而下降，但其开花植株普遍较矮小，未开花植株比开花的植株要更高大、壮硕一些。可能是植物的开花消耗了植株体内的一些营养物质，所以开花的植株长势较为矮小，而未开花的植株长势更为健壮。研究结果为以后的实际生产提供了可靠的科学依据与技术参考。