顶空毛细管GC法测定佐匹克隆原料药中有机溶剂的残留量
2022-06-08兰为环张绿茵李爽唐海
兰为环，张绿茵，李爽，唐海
（江苏天士力帝益药业有限公司，天津 300400）
佐匹克隆（Zopiclone）是法国赛诺菲-安万特公司（Sanofi-Aventis）于1987年12月上市的第一个非苯二氮䓬类失眠治疗药物，是环吡咯酮类第三代催眠镇静药物的代表，具有镇静、抗焦虑、抗惊厥和肌肉松弛作用。其原料药合成过程中使用了多种有机溶剂[1-2]，均需要采用有效方法对其残留量进行控制以保证产品的安全性。现有检测方法[3-4]多针对第三类溶剂和部分第二类溶剂进行检查，并未对合成工艺中用到的第二类溶剂二甲苯及可能含有的第一类溶剂苯进行检测，本文参照2020年版《中国药典》和ICH 的相关要求[5]，根据药物合成工艺，选取了苯、三氯甲烷和二甲苯作为残留溶剂的控制项目，拟定限度分别为0.000 2%、0.006%和0.217%，开发了顶空毛细管气相色谱法对其进行有效检查。通过对佐匹克隆中残留溶剂专属性、准确性等进行研究[6]，从而确认检测方法的有效性、可靠性，进而达到对产品中这几个残留溶剂准确检测和控制的目的。
1 仪器和试药
1.1 仪器
7890A 型气相色谱仪，配有7697A 型顶空自动进样器（安捷伦有限公司）；XS-105 型电子分析天平（梅特勒-托利多公司，精度为十万分之一）。
1.2 试药
佐匹克隆原料药（批号：18000491、17000017、17000016，自制），二甲苯（色标试剂，批号：20131105，天津威晨化学试剂有限公司），苯（色谱纯，批号：H1520010，阿拉丁），三氯甲烷（含量≥99.0%，批号：20161102，利安隆博华（天津）医药化学有限公司）。
2 方法和结果
2.1 色谱条件
以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷为固定相的毛细管为色谱柱（DB-624，30 m×0.32 mm×1.8 μm），起始温度为40 ℃，维持5 分钟，以每分钟20 ℃的速率升温至100 ℃，再以每分钟10 ℃的速率升温至160 ℃，再以每分钟40 ℃的速率升温至240 ℃，保持5 分钟；进样口温度200 ℃；检测器温度250 ℃；FID 检测器，以氮气为载气，流速为每分钟2.0 mL，分流比为3∶1。顶空瓶平衡温度为85 ℃，平衡时间为30 分钟，定量环温度85 ℃，传输线温度100 ℃。
2.2 溶液的配制
2.2.1 空白溶剂 精密量取二甲基亚砜（DMSO）5 mL，置于顶空瓶中，密封。
2.2.2 对照品溶液 取三氯甲烷、苯与二甲苯各适量，精密称定，用二甲基亚砜定量稀释制成每l mL 中分别约含0.006 mg、0.4 μg、0.2 μg 与0.217 mg 的混合溶液，精密量取5 mL，置20 mL 顶空瓶中，摇匀，密封，作为对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液 取本品约0.5 g，精密称定，置20 mL 顶空瓶中，精密加入二甲基亚砜5 mL，密封，振摇使混合成混悬液（顶空加热可使溶解）作为供试品溶液。
2.2.4 供试品加标溶液：精密称定佐匹克隆0.5 g，置顶空瓶中，加入2.2.1 节5 mL 对照品溶液，密封，振摇，使成混悬液后，作为供试品加标溶液。
2.3 专属性考察
取三氯甲烷适量，用DMSO 溶解并稀释制成每l mL 中分别约含0.06 mg 的三氯甲烷定位溶液；取苯适量，用DMSO 溶解并稀释制成每l mL 中分别约含4 μg 的苯定位溶液；取二甲苯适量，用DMSO 溶解并稀释制成每l mL 中分别约含2.17 mg 的二甲苯定位溶液；取上述三氯甲烷、苯、二甲苯定位溶液，及2.2 节空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液，分别精密量取5 mL，置于顶空瓶中，密封，顶空进样，按照2.1 节色谱条件测定，记录色谱图。结果如表1及图1所示，实验结果显示空白溶剂、佐匹克隆主峰对残留溶剂测定无干扰，各杂质峰之间，分离度均大于1.5，佐匹克隆残留溶剂测定方法专属性良好。
表1 专属性试验结果Tab.1 The result of exclusivity
图1 GC 色谱图Fig.1 Gas chromatograms
2.4 检测限和定量限考察
取“2.2.2”项下对照品溶液，逐级稀释，当S/N 约为10 时，三氯甲烷、苯、二甲苯定量限分别为1.78 μg/mL、0.064 5 μg/mL、0.390 μg/mL；当S/N 约为3 时，三氯甲烷、苯、二甲苯检测限分别为0.446 μg/mL、0.016 1 μg/mL、0.086 6 μg/mL。
2.5 线性关系考察
在定量限浓度至不低于150%指标浓度的范围内取6个浓度点，分别精密量取5 mL，各取三份，按照2.1节的色谱条件进行测定，记录色谱图，考察各组分浓度与峰面积的线性关系，并以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，用最小二乘法计算线性回归图，结果表明三氯甲烷在1.79～8.37 μg/mL 浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=0.877 7x-0.047 4，r=0.996 1，苯在0.06～0.30 μg/mL 浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=29.790 4x-0.028 4，r=0.996 9；二甲苯在0.39～324.75 μg/mL 浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=10.208 8x-27.354 5，r=0.997 6。说明该方法在规定的质量浓度范围内线性关系良好。
2.6 准确度
按2.2 节供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液2 份，作为空白供试品溶液；精密称取供试品约0.5 g，置顶空瓶中，称取12 份，分别精密加入相当于三氯甲烷及苯定量限（3 份）、二甲苯定量限（3 份）、100%（3 份）和120%（3 份）限度的溶液各5 mL，密封，振摇，混合均匀，顶空进样。按照2.1 节的色谱条件进行测定，记录色谱图，计算回收率。结果如表2所示，该方法的准确度较高，适用于佐匹克隆原料药中3 种溶剂的残留量测定。
表2 回收率测试结果Tab.2 Data of the recovery test
（续表）
2.7 精密度
2.7.1 仪器精密度实验
取2.2.2 节对照品溶液5 mL，置于顶空瓶中，密封，取6 份，顶空进样，进样6 次。根据谱图分别记录三氯甲烷、苯及二甲苯的峰面积，结果表明三氯甲烷、苯、二甲苯峰面积的RSD 依次分别为2.1%、1.5%，1.7%，仪器精密度良好。
2.7.2 方法精密度实验
分别按2.2节配制方法对照品溶液平行配制2份，供试品溶液平行配制6 份，供试品加标溶液平行配制6 份；精密量取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液及供试品加标溶液各5 mL，分别置各顶空瓶中，密封，顶空进样；根据测定结果按外标法以峰面积计算供试品溶液中残留溶剂量及其相对标准偏差。结果显示供试品溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯均未检出；供试品加标溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯回收率的RSD 依次分别为2.6%、1.9%、1.6%，方法精密度良好。
2.7.3 中间精密度
按2.2 节各溶液方法配制，由不同的分析人员、不同时间、不同仪器按2.1 节色谱条件依次测定，记录色谱图，结果显示，供试品溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯均未检出；12 份供试品加标溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯回收率的RSD 依次分别为4.3%、4.5%、2.4%，中间精密度良好。
2.8 耐用性
2.8.1 溶液稳定性
按“2.2”项下配制空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液，分别精密量取5 mL 分别置各顶空进样小瓶中，密封，室温放置，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、42 h 顶空进样，进样分析，记录色谱图。结果显示室温放置42 h，对照品溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯峰面积RSD 分别为2.3%、2.2%、2.9%；供试品溶液中均未检出相关溶剂；供试品加标溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯溶剂峰面积RSD 分别为2.1%、2.0%、1.6%；佐匹克隆原料药残留溶剂检测对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液室温放置在42 h 内稳定性良好。
2.8.2 耐用性
按2.2 节配制空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液，分别考察不同流速、顶空温度、柱升温程序的影响，按照2.1 节色谱条件进样测定，记录色谱图，结果显示对照品溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯峰面积RSD 依次为2.7%、4.4%、2.1%；供试品溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯均未检出；供试品加标溶液中三氯甲烷、苯、二甲苯回收率的RSD依次为3.0%、3.5%、3.6%；该方法耐用性良好。
2.9 样品检测
分别取佐匹克隆原料药18000491、17000016、17000017 三个批次的样品进行测试，结果显示该三批样品中三氯甲烷、苯、二甲苯均未检出。
3 结论
本文对佐匹克隆原料药合成工艺中使用到的毒性溶剂苯、二甲苯和三氯甲烷的控制方法进行了研究，采用顶空毛细管气相色谱法进行测定，并对该方法进行了系统的方法学验证，实验结果显示，三氯甲烷、苯及二甲苯3 种有机溶剂均完全分离，空白溶剂无干扰；3 种溶剂的定量限分别为1.78 μg/mL、0.064 5 μg/mL、0.390 μg/mL，分别在1.79～8.37 μg/mL、0.06～0.30 μg/mL、0.3～324.75 μg/mL 浓 度 范 围 内线性关系良好，3 种溶剂的回收率分别为100.0%（RSD=1.8%，n=9），99.0%（RSD=1.8%，n=9）和96.8%（RSD=1.1%，n=9），准确度良好；变动分析方法中不同流速、顶空温度、柱升温程序，对测定结果无显著影响，方法耐用性良好。以上结果表明该方法灵敏度高，检测结果准确可靠，适用于佐匹克隆原料药中三氯甲烷、苯、二甲苯的测定。
