重症肺结核患者T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表达及其预后意义

吴多池，钟业腾，王玉峰, 吴烨莹，赵庆珠

肺结核的主要致病菌为结核分枝杆菌，其主要临床表现为四肢乏力、低热、盗汗，并伴有咳嗽、咳痰、咯血等，且部分患者可出现呼吸困难，该病能够使机体多个器官受到牵连[1-2]。随着病情加重，可发展为以大咯血、呼吸衰竭、结核性脑膜炎等为主要特征的重症肺结核。据临床报道，全球每年新增肺结核患者至少987万例，其已发展为全球范围内较为致命的一种感染性疾病[3]。诸多临床研究结果显示[4-6]，肺结核的进展一方面与致病菌的数量、毒性关系密切，另一方面与机体自身的免疫状态有关。近年来，研究发现T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)是一种特定表达于Th1和Th2上的Ⅰ型膜表面蛋白分子，其在机体免疫功能的调节中发挥重要作用[7]。TIM-3是临床最早发现的TIM分子，其属于免疫负调控分子之一，可在T细胞、树状细胞等细胞表面进行表达，能参与CD4+T淋巴细胞介导的免疫应答反应；TIM-1可在CD8+T淋巴细胞中的增殖、分化等方面发挥调节作用。目前，临床尚无重症肺结核患者中TIM-1、TIM-3水平变化的相关报道。本研究通过检测外周血T细胞亚群(CD4+、CD8+)、TIM-1、TIM-3在重症肺结核患者中的表达，并与健康人群进行比较，旨在探讨其与病情严重程度、预后等关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2019年1月至2021年6月在我院收治的1 056例重症肺结核患者的临床资料，并将其定义为重症肺结核组，另随机选取同期在我院进行治疗的1 000名轻症肺结核者作为轻症肺结核组。纳入标准：年龄20～60岁者；符合中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布的《肺结核诊断》[8]中有关重症肺结核诊断标准者；经影像学和实验室生化指标检查确诊者；病灶范围至少3个肺叶，且形成空洞者；需长期排痰，并伴有显著的结核中毒症状者；以往从未采用免疫抑制剂治疗者。排除标准：经痰培养结果显示为阴性者；合并其他恶性肿瘤者；伴有慢阻肺、哮喘和支气管扩张等其他类型感染性疾病者；临床资料不全者。本研究经我院医学伦理委员会批准同意，且所有纳入对象均知情同意。

1.2 方法 采集两组纳入患者的晨起空腹静脉血8 mL，其中5 mL用于T淋巴细胞亚群及荧光定量PCR检测，另3 mL离心取血清备用。

1.2.1 检测TIM-1、TIM-3的mRNA转录水平 采用荧光定量PCR(南京学静生物科技有限公司，型号：ABI QuantStudio 5，原产地：新加坡)检测提取待测的PBMC mRNA的表达情况，具体步骤：1)采用密度梯度离心法分离PBMC；2)采用淋巴细胞分离液(美国GE公司)将外周血淋巴细胞分离，然后按照说明书要求提取外周血淋巴细胞中含有的RNA并纯化，对纯化后的RNA进行逆转录得到cDNA；3)采用荧光定量PCR检测PBMC中TIM-1、TIM-3 mRNA水平，β-actin基因为内参基因，引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.2.2 采用流式细胞分析法测定T淋巴细胞亚群及TIM-1、TIM-3水平 将抗体CD4-FITC/CD8-PE分别加入标本，经充分震荡、避光、室温孵育，15 min后做溶血处理。完毕后后采用全自动细胞检测仪(上海巴玖实业有限公司，型号：bio-rad TC20，原产地：美国)检测外周血CD4+、CD8+及TIM-1、TIM-3水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0统计分析，计数资料比较采用χ2检验；计量资料的组间比较用独立t检验，检验水准α=0.05。TIM-1、TIM-3与CD4+、CD8+间行 Spearman相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料比较 两组纳入对象的年龄、性别比较，差异均无统计学意义(t=0.913,χ2=1.322,均P>0.05)，两组有可比性，见表2。

表2 两组纳入对象一般资料比较Tab.2 Comparison of general data between groups

2.2 两组外周血CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比较 重症肺结核组CD8+、TIM-1和TIM-3水平均高于轻症肺结核组(tCD8+=24.388,tTIM-1=17.821,tTIM-3=47.465,均P<0.001)，CD4+水平低于轻症肺结核组(t=40.971，P<0.001)，见表3。

表3 两组外周血CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比较Tab.3 Comparison of peripheral blood CD4+, CD8+, TIM-1 and TIM-3 levels between groups %]

2.3 两组TIM-1、TIM-3的mRNA水平比较 重症肺结核组TIM-1 mRNA和TIM-3 mRNA水平均高于轻症肺结核组(tTIM-1=42.046,tTIM-3=35.218,均P<0.001)，见表4。

表4 两组TIM-1、TIM-3的mRNA水平比较Tab.4 Comparison of TIM-1 and TIM-3 mRNA levels

2.4 重症肺结核患者TIM-1、TIM-3与预后的关系

1 056例重症肺结核患者在治疗过程中存活605例，死亡451例。

表5 存活组与死亡组临床资料比较Tab.5 Comparison of clinical data between the survival group and death group

2.4.2 存活组与死亡组CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比较 死亡组CD8+、TIM-1和TIM-3水平均高于存活组(tCD8+=11.650,tTIM-1=13.411,tTIM-3=18.613,均P<0.001)，CD4+水平低于存活组(t=23.722，P<0.001)，见表6。

表6 两组外周血CD4+、CD8+、TIM-1、TIM-3水平比较Tab.6 Comparison of peripheral blood CD4+, CD8+, TIM-1 and TIM-3 levels between groups

2.4.3 存活组TIM-1、TIM-3与CD4+、CD8+水平间的相关性水平比较 相关性分析发现：存活组患者TIM-1、TIM-3与CD4+均呈负相关(r值分别为-0.114和-0.211，P<0.05)，而与CD8+均呈正相关(r值分别为0.571和0.680，P<0.05)。

3 讨 论

肺结核作为一种慢性感染性疾病，据WHO最新调查结果显示，中国的肺结核患者在全球中的占比为9%左右，该病负担在全球排名第2[9]。当前，虽然大部分人群已接种卡介苗，但耐多药结核分枝杆菌的出现，导致肺结核患者呈上升趋势。研究发现，当机体感染结核分枝杆菌后并不会立即发作，而是当机体免疫功能减弱或出现细胞介导变态反应升高，细菌大量增生后可致病，若期间未采取综合措施，可致病情进展为重症肺结核[10]。一旦形成重症肺结核，可致机体肺组织发生大范围的空洞，或出现大量的纤维化等，进而使得患者合并呼吸衰竭，对其生命安全造成严重影响。

有报道显示，外周血T淋巴细胞的表达与重症肺结核的预后转归关系密切[11]。结核分枝杆菌作为肺结核的主要致病菌，其属于胞内病原体，而抗致病菌的免疫机理则是以T淋巴细胞产生的细胞免疫为主，体液免疫将不占据主导地位。在细胞免疫中发挥关键作用的是CD4+T淋巴细胞亚群。CD4+T淋巴细胞亚群能够在机体内释放不同类型的细胞因子，主要类型包括Th1和Th2两个亚型，各个因子之间互相协同，发挥各自的生物学效应，最大程度的在机体内发挥免疫保护作用，CD8+T淋巴细胞亚群的主要作用是打破结核分枝杆菌的生存环境，并抑制其增殖分化，进而保护机体[12-13]。有学者通过搜集106例重症肺结核患者的研究资料，分析其病情，研究其与T淋巴细胞间的关系，结果表明，当机体出现T淋巴细胞表达失调，且失调程度越显著，病情程度越严重[14]。本研究结果表明，重症肺结核组CD8+水平高于轻症肺结核组，CD4+水平低于轻症肺结核组，并且死亡组CD8+水平高于存活组，CD4+水平低于存活组，且相关性分析发现：存活组患者TIM-1、TIM-3与CD4+均呈负相关，而与CD8+均呈正相关。说明T淋巴细胞亚群在体内的表达与机体抗结核分枝杆菌的能力有关，提示其与疾病的转归、预后关系紧密。

多数研究结果证实，T细胞的有效活化及功能介导一方面需要特异性抗原信号，另一方面则与协同刺激分子提供的信号密不可分[15-17]。有学者指出[18]，在机体内一旦出现TIM分子(TIM-1和TIM-3)的表达变化极可能造成细胞免疫紊乱。TIM-3是目前临床研究较为关注的负性系统刺激因子，其是由外国学者在寻找Th1和Th2两个亚型细胞表面的特异性标志物的过程中发现的。TIM-3的主要作用是与其配体相结合，进而对Th1细胞的免疫功能进行下调，并诱导、促使聚集的Th1细胞发生凋亡。通过对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等传染性疾病的研究，均能够发现TIM-3能够有效抑制T细胞的增殖，将该通路上的信号进行阻断时，能够利于T淋巴细胞亚群抗病毒免疫应答的部分作用，进而发挥负性调节作用。TIM-1能够在病毒感染性疾病中发挥至关重要的作用[19-20]。本研究结果显示，重症肺结核组TIM-1和TIM-3水平均高于轻症肺结核组，且TIM-1 mRNA和TIM-3 mRNA水平均高于轻症肺结核组。同时，死亡组TIM-1和TIM-3水平均高于存活组。提示TIM分子有可能是重症肺结核进展中的一个关键靶点，并对机体的细胞免疫功能造成一定影响。但本研究也有一定的局限性，搜集的样本为单中心样本，且考察指标具有一定的局限，不能完全阐述TIM分子与其它指标关联性，这仍需后续研究以证实。

综上所述，重症肺结核患者免疫功能紊乱可能与其体内外周血T细胞亚群水平异常以及TIM-1、TIM-3 高表达有关，后期对相关指标检测可利于对病情整体的把控。

利益冲突：无

引用本文格式：吴多池,钟业腾,王玉峰，等. 重症肺结核患者T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表达及其预后意义[J].中国人兽共患病学报，2022，38(5)：400-404. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.049