基于网络药理学探讨柴胡治疗非酒精性脂肪性肝病机制

田新才，杨梅，赵琦，张飞，郭震凡，唐云

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是以弥漫性肝细胞脂肪变性和肝脏脂肪贮积为主要病理特征的一类代谢应激性肝损伤综合征。越来越多的证据表明NAFLD 的形成是多因素共同作用导致的涉及多系统的，可能与多种内分泌代谢疾病、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等共同存在的一种与代谢紊乱有关的疾病［1］。肥胖、糖尿病或其他代谢相关疾病等导致肝脏脂质代谢失衡，游离脂肪酸（FFA）蓄积于内，使肝细胞脂肪变性，即非酒精性单纯性脂肪肝（NAFL），过多FFA 产生脂毒性诱导氧化应激、胰岛素抵抗导致炎症反应，这种作用是双向发展的，容易形成恶性循环，造成肝脏损害，形成非酒精性脂肪性肝炎（NASH），若治疗不及时，NASH 可以进一步发展为肝纤维化及肝硬化，最终激发癌症通路，形成肝细胞癌（HCC）［2-5］。过去几十年成人NAFLD 发病率为6.3%～45%，其中NASH 的发病率占10%～30%［6］。近年来NAFLD 的发病人数日渐增加，且发病年龄呈现下降趋势［7］。据调查，全球NAFLD 的流行率约为25%，儿童和青少年NAFLD 的患病率约10%，最小患者只有2 岁，最年轻的NASH 相关肝硬化患者为8 岁［8］。

因NAFLD 致病因素多，机制复杂，目前尚无治疗NAFLD 特效药，除改变生活方式、调整饮食结构之外，大多从改善胰岛素抵抗、抗氧化、调节脂质代谢、调节肠道菌群等方面着手治疗。中医药辨证论治时讲究“三因制宜”，即个体化治疗，临床疗效显著；经长期临床实践，因其有效性及安全性被越来越多的人接受，虽临床上疗效显著，但缺乏客观指标和量化证据，不易推广。

柴胡能疏散退热，疏肝解郁,清胆截疟，升举阳气［9］；《神农本草经》［10］称之为“茈胡”，又名“地薰”，为上品，其“味苦，平。主心腹，去肠胃中结气、饮食积聚、寒热邪气，推陈致新”。据《雷公炮制药性解》［11］记载，“味苦，性微寒，无毒，入肝、胆、心包络焦、胃、大肠六经。主伤寒心中烦热，痰实肠胃中，结气积聚，寒热邪气，两胁下痛，疏通肝木，推陈致新……凡胸腹肠胃之病因热所致者，得柴胡引清去浊而病谢矣，故入肝胆等经。”马骥运用柴胡剂时增设小柴胡汤腹证，凡以“胸胁苦满”为主证，伴胸中壅塞胀满、心窝部发硬、肋弓下压痛、肝区紧张疼痛、上腹角狭窄者均属于此［12］。白宗利［13］、孙慧敏［14］通过对比研究发现醋柴胡毒性较生柴胡毒性小，保肝作用强；酒制柴胡较其他柴胡炮制品有更好的抗炎作用。综合而言，现代药理学研究发现，柴胡在免疫调节、脏器保护（保肝）及抑制纤维化（肝肺等）、抗炎、抗病毒、抗肿瘤以及心血管、血液系统等方面发挥着重要作用［15］。

本研究利用网络药理学数据平台对柴胡治疗NAFLD 的有效成分及作用靶点进行分析，为中医药治疗NAFLD 提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 柴胡活性成分及靶点预测

利用中医药系统药理学平台TCMSP 数据库［16］（https:lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）搜索柴胡的所有化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性指数（drug-like index，DL）≥0.18 为基点确定药物有效成分，然后根据Mol ID 逐一查找有效成分对应的潜在蛋白靶点，结合Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php），导入在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得上述成分的SDF 格式化学结构文件,限制种属“homo sapiens”,点击预测并导出结果,将二者所得结果合并、去重，即得到药物活性成分靶点,再通过UniProt 数据库［17］（http://www.uniprot.org/）对蛋白名称进行标准化，选择物种为“Human”，下载已证实的人类基因，利用EXCEL 表格函数对药物靶点基因全称进行symbol 转换。

1.2 NAFLD 疾病相关靶点获取

通过GeneCards［18］数据库（https://www.Genecards.org/）以“non-alcoholic fatty liver disease”为关键词检索收集NAFLD 疾病相关靶点，纳入了所有条目信息，删除多余重复的靶点，即得到NAFLD 的相关靶点。

1.3 柴胡治疗NAFLD 的网络构建及分析

将筛选出的柴胡与NAFLD 疾病靶点输入Draw Venn Diagram（Venn 图）在线软件平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/）中将数据转换成可视化Venn 图。再运用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物-活性成分-疾病靶点的可视化网络。

1.4 柴胡与NAFLD 的靶点蛋白-蛋白互作网络（PPI）分析

运用string 11.0 数据平台（https://string-db.org/），将上传至在线string 数据库，设置蛋白种类为“homo sapiens”，设置最低置信度为0.7，其他参数设置不变，去掉网络中的单一节点，构建从网络分析获得的关键蛋白PPI 网络。再次通过Cytoscape软件将生成的“string interactions.tsv”文件进行拓扑学分析，根据节点的degree 和颜色深浅选出核心靶点，即获得柴胡潜在治疗靶点的PPI 网络图［19］。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 生物通路富集分析

GO 功能富集分析和KEGG 生物通路富集分析分别是针对各种物种的基因功能和基因产物在细胞中的代谢途径及功能进行富集程度分析的一种方法。Metascape 是实验生物学家在大数据时代全面分析和解释当前广泛的生物数据库的有效工具［20］。通过Metascape 数据库［20］对关键靶点进行GO 富集功能分析，如生物过程（biological process,BP），细胞成分（cellular component,CC），分子功能（molecular function,MF），获得GO 富集分析结果（P＜0.01）；对关键靶点进行KEGG 信号通路富集分析，获得显著富集的信号通路（P＜0.01）。最后利用Cytoseape软件对GO 富集和KEGG 富集分析数据进行处理和可视化处理,以此探讨柴胡治疗NASH 的生物学过程及关键信号通路。

2 结果

2.1 柴胡的主要有效成分及靶点预测

根据OB ≥30%及DL ≥0.18 从TCMSP 数据库中筛选出有效成分17 个，删除其中5 个无对应靶点的成分，最终获得12 个唯一有效成分，见表1。

表1 柴胡主要有效成分表

在TCMSP 数据库中收集12 个有效成分的预测靶点，与Swiss Target Prediction 数据库靶点预测得出的评分值靠前的靶点合并，利用Uniprot 数据库进行标准化处理，删除重复值，得到196 个唯一靶点蛋白。

2.2 疾病靶点获取及绘制Venn 图

将GeneCards 数据库（https://www.Genecards.org/）中查询的NAFLD 疾病相关靶点基因整理并去重，得到1 080 个与NASH 疾病的相关靶点基因；依次将柴胡与NAFLD 的靶点基因导入Draw Venn Diagram（Venn 图）在线软件平台绘制成Venn 图，其中交集靶点共85 个，见图1。

图1 NAFLD与柴胡交集靶点Venn图

2.3 构建“中药-有效成分-疾病靶点”可视化网络图

将有效成分和利用Venn 图筛选出的疾病-药物共有靶点蛋白通过Excel 表格的整合，通过Cytoscape 3.7.2 软件将药物的靶基因196 个与药物-疾病的共同靶点85 个运用Perl 命令符取交集，得到柴胡治疗NAFLD 的有效成分11 个导入Cytoscape 软件中，得到“中药-有效成分-疾病靶点”网络图。图中包括97 个节点（1 种药物、11 个有效成分、85 个相关靶点蛋白），其中槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、乙酸亚油醇酯（Linoleyl acetate）、豆甾醇（Stigmasterol）五种有效成分的作用靶点较多；前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2）、一氧化氮合酶（NOS2）、乙醇脱氢酶（ADH1C）、B2 肾上腺素受体（ADRB2）、黄嘌呤脱氢酶（XDH）、B 细胞白血病/淋巴因子2（BCL2）、糖原合成酶激酶3B（GSK3B）等靶点蛋白分别有多个有效成分与之相互作用；印证了柴胡可能通过多成分、多靶点、多途径治疗NAFLD 的作用。见图2。

图2 柴胡治疗NAFLD的“中药-有效成分-疾病靶点”网络图

2.4 PPI 网络分析

将获得的85 个共有靶点上传至string 11.0 数据网络平台，设置最低置信度为0.7，其他参数设置不变，构建PPI 网络，将生成“string interactions.tsv”文件导入Cytoscape 软件进行拓扑学分析，结果见图3。图中节点代表靶点蛋白，边代表两者之间的联系，degree大小代表节点连线多少，节点圆圈大小与degree 值呈正相关；颜色越深、节点越大表示靶点越关键；每个节点边的数目与关联度呈正比，每个节点的边越多，关联度越大。由此可得到位于前十位的靶点蛋白为丝/苏氨酸蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤蛋白P53（TP53）、过氧化酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、原癌基因（JUN）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2），其中AKT1、TNF、IL-6、IL1β 为柴胡治疗NAFLD 的核心靶点。

图3 “柴胡-NAFLD”蛋白质相互作用网络图

2.5 柴胡治疗NAFLD 基因GO 富集分析

在GO 富集分析中根据enrichment score（富集评分）的高低，校正P值后分别绘制出细胞组分，分子功能，生物过程前20 位的富集分析结果，如图4 所示。各部分按富集程度排序，柴胡治疗NAFLD 的主要生物过程有对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对无机物的反应（response to inorganic substance）、凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、对异物刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）、对营养水平的反应（response to nutrient levels）、血管形态发生（blood vessel morphogenesis）、对类固醇激素的反应（response to steroid hormone）、对肽的反应（response to peptide）、细胞分化的负调控（negative regulation of cell differentiation）、细胞黏附的调节（regulation of cell adhesion）、平滑肌细胞增殖的调节（regulation of smooth muscle cell proliferation）、老化（aging）、对氧气水平的反应（response to oxygen levels）、细胞因子介导的信号通路（cytokinemediated signaling pathway）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）、炎症反应的调节（regulation of inflammatory response）、细胞因子产生的正调控（positive regulation of cytokine production）、对紫外线的反应（response to UV）、内在凋亡信号通路（intrinsic apoptotic signaling pathway）、神经元死亡的调节（regulation of neuron death）；细胞组分主要有膜筏（membrane raft）、细胞外基质（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）、转录调节复合体（transcription regulator complex）、轴突（axon）、细胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）、囊泡腔（vesicle lumen）、细胞器外膜（organelle outer membrane）、核膜（nuclear envelope）、蛋白激酶复合物（protein kinase complex）、晚期内体（late endosome）、富含 ficolin-1 的颗粒管（ficolin-1-rich granule lumen）；主要分子功能有DNA 结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白质同二聚化活性（protein homodimerization activity）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白酶结合（protease binding）、丝氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）、肽结合（peptide binding）、组蛋白脱乙酰酶结合（histone deacetylase binding）、激酶调节活性（kinase regulator activity）、整合素结合（integrin binding）、肿瘤坏死因子受体超家族结合（tumor necrosis factor receptor superfamily binding）、细胞外基质结合（extracellular matrix binding）、趋化因子受体结合（chemokine receptor binding）、黄素腺嘌呤二核苷酸结合（flavin adenine dinucleotide binding）、一氧化氮合酶调节活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、R-SMAD 绑定（R-SMAD binding）、NF-κB结合（NF-kappaB binding）。

图4 柴胡治疗NAFLD的GO富集分析

2.6 柴胡治疗NAFLD 的KEGG 通路富集分析

通过KEGG 信号通路富集分析得出柴胡治疗NAFLD 的信号通路主要涉及炎症、抗癌等方面，如癌症通路（pathways in cancer）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙型肝炎（hepatitis C）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、大肠癌（colorectal cancer）、内分泌抵抗（endocrine resistance），详见图5。KEGG通路富集分析发现，癌症通路（Pathways in cancer）含有37 个靶点，是含有靶点最多的通路。

图5 柴胡治疗NAFLD的KEGG通路富集分析

3 讨论

中医古籍中关于NAFLD 的论述，最早的记载见于《难经》，称之为“肥气”；《济生方》卷四：“肥气之状……诊其脉，弦而细，其色青，其病两胁下痛，牵引小腹，足寒转筋，男子为积疝，女子为瘕聚”。根据其病因、病机、症状，可将其归属于“肝癖”“积聚”“胁痛”“肥气”“肝胀”等范畴。《非酒精性脂肪肝病中医诊疗专家共识（2017）》［21］将NAFLD 命名为“肝癖”,认为其主要病因大体可归纳为五点：饮食不节、情志失调、劳逸失度、久病体虚、禀赋不足。《非酒精性脂肪肝病中医诊疗指南》［22］指出本病病位涉及脾、肝、肾三脏，与痰、湿、浊、瘀、热等病理因素有密切关系，证属本虚标实，肝脾肾三脏功能失调为本，痰浊血瘀为标。《金匮要略》有云:“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”，经数据挖掘研究发现［23-24］，治疗NAFLD 的药物主要归于药物归经以肝、脾二经为主，柴胡为治疗NAFLD 的主要药物之一，对肝脏有良好的保护作用。

通过“药物-成分-疾病靶点网络图”中Degree 值得出，槲皮素、山柰酚、豆甾醇、异鼠李素、乙酸亚油醇酯为柴胡治疗NAFLD 的主要活性成分。槲皮素、山柰酚、异鼠李素均属于黄酮类化合物，黄酮类化合物广泛存在于各种植物、水果、蔬菜中，具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节、抑制胰岛素抵抗、保护心脑血管作用，在临床上运用广泛［25］。槲皮素是柴胡治疗NAFLD 的主要有效成分之一，多项研究表明槲皮素可通过调控脂质代谢相关基因、炎症相关基因的表达,减轻肝脏的氧化应激，减少脂质合成，减少肝脏脂质蓄积，改善肝细胞脂肪变性；同时能改善胰岛素抵抗［26-31］。在肝脏中，山柰酚可以上调PTEN、caspase-3、JAK1、Tyk2、STAT1/2、内源性IFN-α 调节基因表达，下调线粒体膜电位、SOCS3、STAT3、miR-21、PI3K/AKT/mTOR 信号通路、磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)/AKT（蛋白激酶B）和人类 T 细胞白血病/淋巴瘤病毒-I（HTLV-I）信号通路来达到抗炎抗氧化，并抑制 NFκB 通路、下调相关标志物蛋白质的表达来诱导癌细胞凋亡，从而达到抗癌目的［32-34］。

由KEGG 通路富集分析和PPI 互作图可看出，AKT1、TNF、IL-6、IL-1β、TP53、PPARG、CASP3、JUN、VEGFA、PTGS2 与柴胡治疗NAFLD 存在密切联系，其主要通路涉及癌症通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、丙型肝炎、HIF-1信号通路、大肠癌、内分泌抵抗等。研究显示，AKT1 为一种存在大多数癌症中过度表达的原癌基因，是多种人类恶性肿瘤的标志，AKT 调控的通路是人类癌症中最常被激活的信号通路［34-36］。TNF 是一种促炎因子，在炎症反应及多种细胞功能中起关键作用，如凋亡、增殖、线粒体动力学等［37］。研究表明TNF 能抑制抗炎细胞因子脂联素，减弱机体对胰岛素敏感性，发生胰岛素抵抗；而且肝脏纤维化程度与TNF 的表达水平成正比［38-39］。IL-6 既是细胞因子，又是免疫调节因子、脂肪因子，NAFLD 的发生发展与IL-6 和TNF-α 有密切关系，与胰岛素抵抗呈正相关［40-41］。通过动物及体外细胞实验发现，山柰酚通过降低CASP3 蛋白的表达水平，减少氧化应激导致的肝细胞凋亡通路的激活，抑制肝纤维化的发展，减慢或缓解NAFLD 的发生发展［42-43］。结合GO 富集分析进一步研究柴胡治疗NAFLD 的作用机制，分析结果表明柴胡通过对脂多糖的反应、对无机物的反应、凋亡信号通路、对异物刺激的反应、血管形态发生、对氧气水平的反应、细胞因子介导的信号通路、炎症反应的调节、细胞因子产生的正调控等生物过程及DNA 结合转录因子结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白激酶结合、氧化还原酶活性、细胞因子受体结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等分子反应上，进而调控癌症通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化和HIF-1 信号通路等发挥柴胡对肺癌细胞的抑制作用。HIF-1 信号通路中通过减少HIF-1信号通路中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、低氧诱导因子1α 蛋白表达,上调血管内皮因子A 蛋白表达而调节机体的细胞凋亡、炎症反应、血管生成、对氧气水平的反应等多种生物功能,达到保护肝脏的目的［44］。

综上所述，本研究利用网络药理学这一研究工具，初步分析了柴胡治疗NAFLD 的作用机制，共涉及槲皮素、山柰酚、豆甾醇、异鼠李素等11 种有效成分，AKT1、TNF、IL-6、CASP3 等多靶点与癌症途径、HIF-1 信号通路等多通路参与的细胞凋亡、炎症反应、氧化应激反应的治疗机制。本研究从药理作用及作用机制方面阐述了柴胡治疗NAFLD的科学依据，但药物单一，需进一步考虑中药复方的复杂性及患者的个体差异性。