脂肪乳改善布比卡因致大鼠心脏毒性机制的研究

张淑娟,孟令群,黄翠影,韩庆波,蔡立松,李 军*

1.唐山市开滦总医院手麻科,唐山 063000;2.唐山市妇幼保健院儿内科,唐山 063000

布比卡因(bupivacaine,BPV)是临床上常用的一种长效酰胺类局部麻醉药,具有高效、长效、价格低廉等优点[1]。但BPV局部吸收过量或因操作不慎误入血管会导致血浆药物浓度迅速升高,一旦超过机体耐受能力,就会引起致命的心脏中毒反应,甚至导致心脏停搏[2]。肾上腺素是治疗心血管系统功能衰竭的首选药物,但其无法纠正由BPV引起的心脏功能抑制,反而会加重临床患者的中毒症状[3]。脂肪乳(lipid emulsion,LE)是能量和脂肪酸的供体,其对脏器的保护作用越来越受到学者们的关注,有研究表明其能够有效治疗由局部麻醉药引起的全身毒性[4]。近年来,有临床个案和动物实验表明,LE对BPV所致的心脏毒性具有良好的救治作用[5-6]。PARTOWNAVID P等[7]认为,LE减轻BPV所致的心脏毒性可能与脂肪酸氧化以及抑制线粒体通透性转运孔的开放有关。本研究旨在探究LE改善BPV致大鼠心脏毒性的机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ti2型倒置显微镜(日本Nikon公司);SEN27103型电子刺激器(美国IonOptix公司);Allegra TM 1E-80K型高速离心机(德国Eppendorf公司);心电图仪(BL-420 F型生物机能实验系统,成都泰盟科技有限公司);Tanon 2500型多功能凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.2 试药

质量浓度为0.234 g·mL-1的LE注射液(华瑞制药有限公司);质量浓度为5 g·L-1的盐酸布比卡因注射液(芜湖康奇制药有限公司);生理盐水(四川科伦药业股份有限公司);应激指标与心肌酶相关指标检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天生物技术研究所);B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和GAPDH一抗(美国Thermo Fisher Scientific公司);HRP标记IgG二抗(英国Abcam公司)。

1.3 动物

50只成年雄性SD大鼠,体质量280～350 g,由医院实验动物中心提供,许可证号SCXK(苏)2018-0315。饲养条件和流程均符合《实验动物管理条例》,在适宜的条件下[温度(21±2) ℃,湿度45%～65%,12 h光/暗循环]进行饲养,大鼠自由饮水和进食。适应性喂养7 d后用于实验。所有实验均经过医院实验动物伦理委员会审批。

2 方法

2.1 分组及实验模型制备

将30只大鼠分为3组,空白对照组、布比卡因对照组和布比卡因+脂肪乳组。空白对照组不做任何处理;用布比卡因对照组和布比卡因+脂肪乳组构建心脏毒性模型。对用于造模的大鼠,缓慢腹腔注射质量浓度为100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)进行麻醉,将大鼠以仰卧位固定于手术操作台上,用3根针式电极针分别插入大鼠左、右上肢及左下肢皮下,监测标准Ⅱ导联心电图(electrocardiogram,ECG)。刮净大鼠左颈部体毛,消毒铺巾,斜行切开皮肤1～2 cm,钝性分离皮下组织和肌肉,使其左颈总动脉暴露,阻断近心端血管,并置入24 G套管针穿刺动脉,置入导管,连接压力传感器,用于监测平均动脉压(mean arterialpressure,MAP)。刮净大鼠右颈部和大腿根部体毛,消毒铺巾,斜行切开皮肤1～2 cm,钝性分离皮下组织和肌肉,使其右颈内动脉、股静脉暴露,置入24 G套管针,用于给药。大鼠经20 s静脉注射质量浓度为5 g·L-1的布比卡因30 mg·kg-1诱发心脏停搏,以构建局麻药致大鼠心脏毒性模型。复苏时,布比卡因+脂肪乳组大鼠静脉注射质量浓度为0.234 g·mL-1的脂肪乳剂5 mL·kg-1,布比卡因对照组静脉注射生理盐水负荷量5 mL·kg-1,随后均以1 mL·kg-1·min-1的速度静脉输注3 min。于大鼠自主循环恢复120 min时将其处死,取左心脏组织。

2.2 各组大鼠心电图测定

缓慢腹腔注射质量浓度为100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠,将大鼠以仰卧位固定于手术操作台上,将心电图仪针状电极与大鼠连接,记录各组大鼠的心电图。

2.3 心脏毒性大鼠心肌组织病理学形态评估

心肌组织标本用质量浓度为100 g·L-1的中性福尔马林固定,用石蜡包埋,5 μm厚度切片,用苏木精和伊红染色,通过HE染色切片观察心肌组织病理变化,由2名资深的组织病理工作者随机盲评。

2.4 应激指标与心肌酶相关指标检测

处死各组大鼠前,进行腹主动脉取血,分离血清,用试剂盒检测血清氧化应激指标超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、NADPH氧化酶-2(NADPH oxidase 2,NOX-2)和一氧化氮水平及心肌酶相关指标肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin-T,cTn-T)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)的水平。

2.5 Western blot检测心肌组织凋亡相关蛋白与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白的表达

取适量心肌组织加入RIPA裂解,置于冰上振荡40 min,4 ℃12 000 r·min-1离心10 min,取上清,用BCA法检测样品蛋白浓度,定量至50～70 μg;经SDS-PAGE电泳,并转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,加入质量浓度为50 g·L-1脱脂牛奶,封闭1.5 h,分别加入一抗稀释液[Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、cleaved caspase-3(1∶2 000)、cleaved caspase-9(1∶2 000)、ERK1/2(1∶2 000)、JNK(1∶1 000)、p38(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶250)、p-JNK(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)],4 ℃孵育过夜,加入辣根过氧化酶标记的二抗,室温孵育1.5 h,滴加ECL发光液,反应30 s,用多功能凝胶成像系统进行检测,并用Image J软件计算灰度值。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 LE对BPV致心脏毒性大鼠心电图的影响

与空白对照组比较,布比卡因对照组大鼠的心电图出现明显异常,表现为ST段改变,给予LE处理后,大鼠心电图异常明显改善。结果见图1。

注:A.空白对照组;B.布比卡因对照组;C.布比卡因+脂肪乳组。

3.2 LE对BPV致心脏毒性大鼠心肌组织病理学的影响

空白对照组大鼠心肌细胞结构完整,心肌纤维排列整齐,心肌细胞未出现萎缩或肥大;布比卡因对照组大鼠心肌细胞出现明显肥大、坏死,损伤严重,心肌纤维排列紊乱,出现炎性细胞浸润;给予LE处理后,大鼠心肌细胞肥大、坏死明显减轻,心肌纤维排列较整齐,炎性细胞浸润明显减轻。结果见图2。

注:A.空白对照组;B.布比卡因对照组;C.布比卡因+脂肪乳组;*表示广泛分离和破坏的坏死心肌纤维区域。

3.3 LE对BPV致心脏毒性大鼠心肌酶相关指标的影响

与空白对照组比较,布比卡因对照组大鼠血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明显升高(P<0.05);与布比卡因对照组相比,布比卡因+脂肪乳组大鼠血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明显降低(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠心肌酶相关指标比较

3.4 LE对BPV致心脏毒性大鼠应激指标的影响

与空白对照组比较,布比卡因对照组大鼠血清SOD活性、GSH水平明显降低(P<0.05),MDA、NOX-2和一氧化氮水平明显升高(P<0.05);与布比卡因对照组相比,布比卡因+脂肪乳组大鼠血清SOD活性、GSH水平明显升高(P<0.05),MDA、NOX-2和一氧化氮水平明显降低(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠应激指标比较

3.5 LE对BPV致心脏毒性大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较,布比卡因对照组大鼠心肌组织Bcl2蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达水平明显升高(P<0.05);给予LE处理后,Bcl2蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结果见图3。

注:A.凋亡相关蛋白Western blot检测结果;B.凋亡相关蛋白相对表达量的比较,与空白对照组比较,*P<0.05;与布比卡因对照组比较,#P<0.05。

3.6 LE对BPV致心脏毒性大鼠心肌组织MAPK信号通路的影响

与空白对照组相比,布比卡因对照组大鼠心肌组织ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平升高(P<0.05);给予LE处理后,ERK1/2、JNK和p-38的磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结果见图4。

注:A～C.p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38和p38 Western blot检测结果;D～F.p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38和p38蛋白相对表达量的比较,与空白对照组比较,*P<0.05;与布比卡因对照组比较,#P<0.05。

4 讨论

BPV一旦误入血管将会发生严重的不良反应,尤其是对心脏和大脑的影响更大[8]。BPV致心脏毒性可引起心脏停搏,目前认为BPV引起心脏骤停的机制主要有两点:第一,通过影响心脏电传导引起室性心率失常;第二,通过抑制线粒体产生ATP,从而抑制心肌能量代谢过程[9-10]。因此寻找一种治疗BPV致心脏毒性的有效方法具有重要的临床意义。

动物实验及离体心脏模型实验[11-12]结果表明,LE治疗可降低BPV诱导所致的细胞死亡,促进心脏功能的恢复。有临床个案报道,LE能够复苏酰胺类局部麻醉药物中毒导致的心脏停搏[13]。但目前LE救治局部麻醉药物所致心脏毒性的确切机制尚不完全清楚。本研究通过静脉注射质量浓度为5 g·L-1的BPV诱发心脏停搏,构建大鼠心脏毒性模型,结果表明,BPV致心脏毒性大鼠的心电图发生明显异常,心肌组织出现明显损伤,血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明显升高,提示BPV致大鼠心脏毒性模型建立成功。为探讨LE对BPV致心脏毒性大鼠的影响,通过静脉注射质量浓度为0.234 g·mL-1的LE进行复苏,结果显示,大鼠心电图异常及心肌组织损伤明显改善,血清CK-MB、cTn-T、LDH和BNP的水平明显降低,提示LE对BPV致心脏毒性具有缓解作用,可明显改善大鼠心肌功能。CK-MB、cTn-T、LDH和BNP是用于诊断再灌注损伤和心肌缺血的重要标志物,OUYANG B等[14]的研究结果亦表明,CK-MB、cTn-T和LDH的水平降低提示心脏功能好转。

研究证实,BPV致心脏毒性的潜在机制与心肌细胞氧化应激密切相关[15-16]。SOD是一种重要的抗氧化酶,能够催化超氧自由基还原为过氧化氢;GSH可直接清除活性氧,间接作为抗氧化酶的辅助因子,SOD、GSH均属于机体酶类抗氧化系统[17]。MDA含量能够提示组织脂质过氧化程度,从而反映细胞受损程度[18]。NOX-2主要分布于心肌细胞,其水平上升提示心肌组织氧化应激增强[19]。在心肌细胞中,一氧化氮可调节心肌细胞的收缩功能,但其含量过多则生成过氧硝酸盐对机体产生毒性[20]。本研究结果显示,LE可使大鼠血清SOD活性、GSH水平升高,MDA、NOX-2和一氧化氮水平降低,提示LE能够减轻BPV所致的心肌应激损伤。YANG L等[21]通过观察LE对BVP致H9C2心肌细胞毒性的作用发现,BPV可明显提高H9C2心肌细胞氧化应激水平,并引起线粒体功能障碍,LE可显著逆转由BVP导致的H9C2心肌细胞毒性。

线粒体对于细胞凋亡有着极其重要的作用,其中bcl-2蛋白家族是主要的凋亡调控因子,包括促凋亡蛋白Bax、caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl2,凋亡过程中Bcl2的表达下调,Bax和caspase-3的表达上调[22]。Bax通过增加线粒体膜通透性转换孔的活性,促进细胞色素C的释放,从而介导细胞凋亡;而Bcl2通过影响心肌细胞线粒体的通透性,抑制细胞凋亡,从而保护线粒体的结构和功能[23]。caspase是凋亡过程中必不可少的部分,线粒体释放细胞色素C进入细胞质,并活化caspase-9,进而激活caspase-3,最终导致细胞凋亡[24]。本研究中,与空白对照组比较,布比卡因对照组大鼠心肌组织中Bcl2蛋白的表达水平明显降低,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达水平明显升高,反映了凋亡在BPV致大鼠心脏毒性中的作用。给予LE处理后,Bcl2蛋白的表达水平明显升高,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达水平明显降低,表明LE在BPV致心脏毒性大鼠中发挥抗凋亡作用,从而保护心肌细胞的完整性,最终减轻心肌损伤。林婷婷等[25]研究发现,LE减轻大鼠BPV心脏毒性的机制可能与抑制线粒体介导的细胞凋亡有关,本研究的结果与之相符。

MAPKs家族是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,除了调控炎症介质之外,还可参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程的调控[26]。MAPK信号通路涉及ERK1/2、JNK、p38 3条亚通路。有研究表明,活性氧可通过激活JNK和p38MAPK,从而促进细胞凋亡[27]。既往的研究显示,MAPK信号通路参与BPV诱导的细胞凋亡过程[28]。本研究的结果也证实MAPK信号通路在BPV致大鼠心脏毒性中的作用。而给予LE处理后,显著抑制BPV诱导的MAPKs活化,提示LE的心脏保护作用可能与调控MAPK信号通路有关。这与PEREIRA S等[29]的研究结果一致,输注脂质可减轻肥胖相关疾病引起的肝脏胰岛素抵抗,这可能与抑制p38MAPK信号通路有关。但LE对BPV致大鼠心脏毒性的作用机制有待进一步研究。

综上所述,LE可改善BPV致大鼠心脏毒性,减轻心肌应激损伤,其机制可能与调控MAPK信号通路抑制细胞凋亡有关。