何首乌多糖对氧自由基及抗氧化酶活性的作用研究

梁闯

何首乌又名紫乌藤、花蓼、夜交藤等,为蓼科植物何首乌的干燥块根［1］。性微温、味苦、涩、甘,具有活血、安神、解毒、强筋骨、补益精血、滋补肝肾之效,为常见贵细中药材［2］。近年来,关于何首乌中蒽醌类、磷脂类化合物和二苯乙烯类成分的研究报道较多,但对于何首乌多糖的研究较少［3］。多糖是生物体内除核酸和蛋白质的另一重要分子,具有多种生物活性,多糖广泛存在于植物、微生物和海藻中,植物中多糖分布尤为广泛,生理活性广泛［4］。有研究表明,何首乌多糖具有抗氧化、抗衰老活性［5］。基于此,本文采用小鼠注射D-半乳糖造模,提取何首乌多糖进行灌胃,研究何首乌多糖对氧自由基及抗氧化酶活性的作用,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择昆明种小鼠40 只,雌雄各20 只,小鼠体重15～25 g,平均体重(20.14±2.14)g。将40 只小鼠随机分为对照组、模型组、小剂量、大剂量何首乌多糖组,每组10 只。

1.2 细胞和试剂 MDA 测试盒(北京灵宝科技有限公司),SOD 测试盒(上海信裕生物科技有限公司),GSHPX 测试盒(上海艾研生物科技有限公司),其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 制备何首乌多糖 取新鲜何首乌粉碎过筛,用体积分数80%的乙醇脱脂,所得残渣用蒸馏水提取,采用苯酚-硫酸法测定提取液中何首乌多糖含量,测得多糖含量为87.6%。

1.4 给药方法 四组小鼠均采用灌胃法给药,对照组和模型组予以对照液(只含防腐剂-尼泊金乙酯)灌胃,小剂量、大剂量何首乌多糖组分别予以50 mg/(kg·d)和150 mg/(kg·d)何首乌多糖灌胃,同时,模型组和小剂量、大剂量何首乌多糖组每日颈背部皮下注射5%D-半乳糖0.5 ml,对照组皮下注射等量生理盐水,灌胃8 周后,断头取血,取小鼠脑、肝、肾等部位进行各项指标测定。

1.5 小鼠血清、肝、肾组织中SOD 活力测定 采用亚硝酸盐法测定,取小鼠10 μl 血清或50 μl 1%的肝、肾组织匀浆,按照测试盒说明书操作,加入试剂,将试管震荡摇匀,37℃水浴40 min,后加入显色剂,10 min后于550 nm 处测吸光度值,用测得结果计算小鼠血清、肝、肾组织中SOD 活力。

1.6 小鼠血清、肝、肾组织中MDA 测定 采用TBA比色法测定,将小鼠血清、肝、肾组织用Tris-HCL 缓冲液配成10%组织匀浆,取0.1 ml 匀浆,按照测试盒说明书操作,加入试剂,将试管震荡均匀,水浴、煮沸40 min,后以3500 r/min 离心,共10 min,于532 nm 处测吸光度值,用测得结果计算小鼠血清、肝、肾组织中MDA 含量。

1.7 小鼠肝、肾组织中GSH-PX 活力测定 采用DTNB 法进行测定,取小鼠0.2 ml 1%的肝、肾组织匀浆和0.2 ml、1 mmol/L 的GSH,37℃水浴温5 min,按照测试盒说明书操作,加入试剂,于37℃术中反应5 min,后以3500 r/min 离心,共10 min,取上清液向其中加入显色剂,室温下静置15 min,于412 nm 处测吸光度值,用测得结果计算小鼠肝、肾组织中GSH-PX 活力。

1.8 小鼠脑组织中LF 测定 采用Sohal 法,取100 mg小鼠大脑,向其中加入4 ml 2∶1 氯仿-甲醇提取液,摇匀,过滤,用提取液洗涤滤渣,合并滤液,加提取液总量至5 ml,测荧光强度。

1.9 观察指标 比较四组小鼠血清、肝、肾组织中SOD 活力、MDA 含量,肝、肾组织中的GSH-PX 活力,脑组织中LF 荧光值。

1.10 统计学方法 采用SPSS21.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差()表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠各组织中SOD、GSH-PX、MDA 对比模型组小鼠血清、肝、肾组织中SOD 活力及肝、肾组织中的GSH-PX 活力均较对照组显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.05)；小剂量何首乌多糖组、大剂量何首乌多糖组小鼠血清、肝、肾组织中SOD 活力及肝、肾组织中的GSH-PX 活力均较模型组升高,且大剂量何首乌多糖组高于小剂量何首乌多糖组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。模型组小鼠血清、肝、肾组织中MDA 含量均较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)；小剂量何首乌多糖组、大剂量何首乌多糖组小鼠血清、肝、肾组织中MDA 含量均较模型组降低,且大剂量何首乌多糖组低于小剂量何首乌多糖组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 四组小鼠各组织中SOD、GSH-PX、MDA 对比()

表1 四组小鼠各组织中SOD、GSH-PX、MDA 对比()

注：与对照组对比,aP＜0.05；与模型组对比,bP＜0.05；与小剂量何首乌多糖组对比,cP＜0.05

2.2 四组小鼠脑组织中LF 荧光值对比 对照组小鼠脑组织中LF 荧光值为(18.04±1.65),模型组为(20.36±1.87),小剂量何首乌多糖组为(16.32±1.35),大剂量何首乌多糖组为(14.68±2.10)。模型组小鼠脑组织中LF 荧光值较对照组升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)；小剂量何首乌多糖组、大剂量何首乌多糖组小鼠脑组织中LF 荧光值较模型组降低,且大剂量何首乌多糖组低于小剂量何首乌多糖组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

在生物生长过程中,生物不断产生氧自由基,包括羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-)以及有机自由基(R-、RO-、ROO-),具有极强的生物活性［5］。少量氧自由基在细胞分裂、生长、解毒、消炎等方面有较大作用,但自由基过剩可诱发生物膜系统与细胞内氧化磷酸酶障碍,从而导致人体发生免疫失调、炎症、恶性肿瘤等疾病,并诱发机体衰老和死亡［6］。

脂质过氧化是氧自由基损伤的主要方式,主要损伤途径为细胞膜脂质+氧自由基-脂质过氧化反应-过氧化脂质-细胞成分+MDA-脂褐质［7］。机体本身具有抗氧化系统,存在如SOD、GSH-PX 等抗氧化酶,SOD 对机体氧化和抗氧化平衡有着重要意义,可有效清除O2-,保护细胞,避免受到氧自由基攻击。GSH-PX对过氧化氢(H2O2)和·OH 有较强的清除能力,可有效保护细胞结构和功能完整。MDA 与LF 含量反映了机体受氧自由基攻击的程度［8］。在疾病状态下,由于多方面因素影响,使机体内自由基的产生和消除过程失衡,就会导致组织、细胞、酶、基因等受损。抗氧化剂可通过增强体内抗氧化系统或清除过剩自由基而起抗氧化作用,因此,研究抗氧化剂对预防疾病有重要意义。D-半乳糖在机体内代谢时,可产生大量自由基,降低机体抗氧化能力,脂质水平增加,引起机体亚急性衰老,主要表现为脂质过氧化产物的堆积和抗氧化物酶活性的降低［9］。

何首乌是常见的一种贵细中药材,其主要入药部位为根块,其有着截疟、消痈、解毒、活络、养血以及安神的功效,且何首乌经过加工处理后,被用在补肝肾、强筋骨、乌须发以及补益精血的过程中。何首乌多糖是何首乌中提取出的一种活性成分,近年来对何首乌多糖的研究表明,何首乌多糖具有抗氧化、抗衰老、免疫调节及抗老年痴呆症作用［10］。相关研究针对何首乌多糖进行了较为全面的深入分析,王娅等［11］从何首乌中提取分离多糖,分析其免疫调节功能的相关情况,采用二维核磁共振波谱对何首乌多糖结构进行切入分析,结合其对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 的相关影响情况,得到最终结论为何首乌多糖作为绝对分子质量为3.96×105的α-1,4-葡聚糖,其进入体内后可以有效促进RAW264.7 细胞的吞噬能力增加,刺激增殖情况的改善,进一步引导小鼠释放出更多的一氧化氮(NO),证明了其存在一定的药用价值,可以有效调节免疫活性。程凯等［12］文献中证实何首乌多糖的使用可以有效改善小鼠体内的氧化情况,有着较为理想的抗疲劳效应。此次研究同上述相关文献均可以从正面或者侧面证明何首乌多糖有可抑制过氧化的功能,均具有一定的研究价值。

本研究中,给予D-半乳糖造模小鼠灌胃50、150 mg/(kg·d)的何首乌多糖,小鼠血清、肝、肾组织中MDA 和脑组织中LF 不同程度下降,血清、肝、肾中SOD 和肝、肾中GSH-PX 活力提高,由此可见,何首乌多糖可抑制脂质过氧化,并明显清除O2-、H2O2等活性氧［11,12］。

综上所述,何首乌多糖在抗脂质氧化、提高内源性抗氧化酶活性、对抗与自由基所致相关疾病方面有重要意义,相关研究人员可以将其作为研究方向进行下一步深入研究,为疾病治疗的临床提供相关指导意义与价值。