1个导致B1型短指的ROR2基因新突变的鉴定

程亚婷，王陈，邱雪平，，马建鸿，马玲，张铭，靳冰玉，赵悦，张元珍，郑芳，（.武汉大学中南医院基因诊断中心＆检验科，武汉 43007；.湖北省产前诊断与优生优育临床研究中心，武汉 43007）

短指症（brachydactyly）又名短趾症，是一类由于指（趾）骨或掌（跖）骨发育异常导致的指（趾）骨缩短、缺失或者融合的家族性遗传病［1］。Temtamy和MeKusiek根据手指畸形的特征，将短指分为A～E型短指、IV型短跖、Sugarman短指、Kirner畸形8种类型［2］。B型短指症是这几种类型中最严重的一种，其根据致病基因的不同又可分为B1型（BDB1）和B2型（BDB2）。BDB1的临床表现为中间指节缩短，同时末端指节缺陷或发育不良，所有手指和脚趾均受累，拇指和大脚趾通常畸形，伴有指甲部分或完全缺失，可有不同程度的指关节粘连、软组织并指等，严重程度因人而异。BDB1呈常染色体显性遗传，致病基因是位于染色体9q22上的ROR2基因。ROR2基因全长235 kb，由9个外显子组成，编码长度为943个氨基酸的“受体酪氨酸激酶样孤儿素受体2”［3］。

我们收集了一个来自湖北武汉的BDB1家系，通过全外显子组测序及临床特征分析，确定为BDB1，致病基因为ROR2。针对候选突变位点设计引物，进行PCR扩增后Sanger测序在家系中验证该突变位点，发现了一个新的杂合突变：c.2239C＞T（p.R747X），丰富了国际ROR2基因突变谱。

1 材料和方法

1.1 研究对象 先证者，女性，以“短指/趾畸形”为主诉就诊于武汉大学中南医院生殖遗传中心咨询门诊。该家系来自湖北省武汉市，汉族，4代共15人，有3人出现短指（趾）症状，符合常染色体显性遗传规律（图1）。经每位成员书面知情同意后，采集家系内3位患者Ⅲ3、Ⅰ2、Ⅱ3和2位未受累亲属Ⅱ4、Ⅱ5的外周血，并收集Ⅲ3、Ⅱ3手足部照片及X线片。本研究得到了武汉大学中南医院伦理委员会的批准（批准文号：科伦2021062）。

图1 BDB1家系图

1.2 外周血基因组DNA的提取 采集静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，采用外周血DNA提取试剂盒（Zymo Research Quick-DNATM Miniprep Plus Kit，USA）提取基因组DNA，然后进行质量鉴定，将提取的DNA产物置于-20℃保存。

1.3 全外显子测序寻找致病基因 以先证者外周血来源的基因组DNA为检测材料，首先用超声将DNA打断并制备文库，然后通过Roche KAPA HyperExome芯片对目标基因外显子及临近剪切区的DNA进行捕获和富集，最后使用MGISEQ-2000测序平台进行变异检测。测序片段通过BWA（Burrows-Wheeler Aligner）与UCSC hg19人类参考基因组进行比对，去除重复。使用基因组分析工具包（GATK，Genome Analysis Toolkit）3.7进行碱基质量值校正SNV、INDEL和基因型检测。使用ExomeDepth进行外显子水平的拷贝数变异检测。

1.4 PCR引物合成 根据全外显子测序结果，针对先证者ROR2基因第9外显子突变位点的位置，用Primer 3.0 plus设计引物，ROR2正向引物序列：5′-AGACATCTGGTCCTACGG-3′，反向引物序列：5′-ATCTGCATTGGGATCTGC-3′。引物由武汉擎科生物公司合成。

1.5 PCR扩增与Sanger测序 PCR扩增体系为50μL，采用南京诺唯赞生物科技公司PCR扩增试剂盒［Vazyme biotech，2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）］，包括25μL 2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus），正、反向引物各2μL（10μmol/L），DNA模板5μL，ddH2O 16μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环35次，72℃继续延伸5 min，4℃保温。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行Sanger测序验证。

1.6 氨基酸保守性分析 在NCBI数据库中获取各物种ROR2蛋白的氨基酸序列文件，用DNAMA软件作图进一步可视化。

2 结果

2.1 临床特征 先证者Ⅲ3，女，31岁。双手拇指外观正常，双手第2～5指远端指节短小，第2手指尤为明显，伴有指甲发育不良（图2A）；双足第2～5趾缩短，大脚趾外观正常（图2B）。X线片显示：双手第2、4～5指中远节指骨骨质融合，关节间隙消失（双手食指末节指骨稍短小），其余各掌、指骨骨质结构正常（图2C）；双足第2～4趾仅见二节趾骨，余足部所示各跖、趾骨及跗骨骨质结构正常（图2D）。其母亲和外祖母表型与其类似都有短指症状，未发现其他异常（图3）。

图2 先证者Ⅲ3手足部照片

图3 先证者母亲Ⅱ3手足部照片

2.2ROR2基因突变分析与验证 通过对先证者的外周血基因组DNA进行全外显子测序，发现其ROR2基因9号外显子上存在c.2239C＞T杂合突变，该突变会导致ROR2基因编码的氨基酸序列上第747位精氨酸错义终止，形成截短蛋白（图4）。根据ACMG指南标准［4］，该变异被判断为致病变异（PVS1+PM1+PM2+PP1），经查询ESP数据库、人类基因突变数据库（HGMD）、EXAC外显子组整合数据库，均未见该变异报道。对家系中Ⅲ3、Ⅰ2、Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅱ5的基因组DNA的9号外显子进行Sanger测序发现，患者Ⅲ3及Ⅰ2、Ⅱ3均存在c.2239C＞T杂合突变，而未受累者Ⅱ4和Ⅱ5该位点正常（图5）。

图4 ROR2蛋白模式图及预测的氨基酸变化

图5 ROR2基因测序图（箭头所指为突变位点）

2.3 氨基酸保守性分析 对ROR2蛋白进行氨基酸保守性分析，发现R747以及下游近30个氨基酸在多个物种中高度保守（图6）。

图6 ROR2蛋白R747及其下游保守性分析

3 讨论

B1型短指（BDB1）是一种常染色体显性遗传病，是短指中最严重的一种，其特征是手指和脚趾的末端缺失，指甲发育不良，中节指骨发育不全及不同程度的指（趾）关节粘连以及伴有拇指（趾）宽大畸形［5］。位于9q22上的酪氨酸激酶受体ROR2基因被认为是致病基因。在本研究中，通过对先证者的临床表型、X线检查、全外显子测序和一代测序验证等多方面分析，确定该先证者ROR2基因存在c.2239C＞T（P.R747X）突变，依据ACMG指南标准［4］，该变异被判断为致病变异（PVS1+PM1+PM2+PP1），经过对其家系进行Sanger测序验证，发现受累者均存在c.2239C＞T突变，该突变在家系中与疾病存在共分离，提示ROR2基因c.2239C＞T突变可能是导致该家系短指表型的原因。此突变导致编码精氨酸的密码子转变为终止密码子，从而产生一个只有747个氨基酸的截短ROR2蛋白。

为了分析R747及其上下游序列对ROR2蛋白功能的影响，我们进行了氨基酸保守性分析，发现R747以及下游近30个氨基酸在多个物种中高度保守，推测该段氨基酸序列对ROR2蛋白的正常功能非常重要。c.2239C＞T突变导致R747及其下游共196个氨基酸缺失，这可能会对ROR2蛋白的功能产生重要影响。

由ROR2基因编码的受体酪氨酸激酶（RTK）样孤儿受体2属于RTK的ROR家族，由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成。参与蛋白质相互作用的细胞外区域包含一个免疫球蛋白样（Ig-like domain，Ig）结构域，一个卷曲的半胱氨酸富集区（Frizzled-like cysteine-rich domains，CRD）和Kringle（Kringle domain，Kr）结构域。细胞内区域包括酪氨酸激酶域（Tyrosine kinase domain，TK），以及2个丝氨酸/苏氨酸富集区（Serine/threonine-rich domain，ST）和1个富含脯氨酸（Proline-rich domain，PR）的结构［6］。由于ROR2的突变产生截短蛋白的类型主要分为近端突变和远端突变。位于跨膜区之后的TK近端突变会导致整个细胞内区域的丢失［5］，临床上发现这种患者的症状较轻微但表型多样。相比之下，位于TK结构域之后的远端突变产生了一个缺乏ST和PR的截短蛋白质，如我们之前所报道的c.2273C＞A［7-8］等，即位于ST1的杂合突变，这种突变患者的表型往往更严重，如手指重度中远端融合，甚至手指缺失，指（趾）甲完全缺失等。少数突变是由于移码突变而产生新的C-末端，如c.2243delC（p.W749fs*24）和c.2249delG（p.G750fs*23）等，研究提示突变ROR2蛋白中额外C-末端肽的产生可能会造成并指表型［9］。本研究中发现的c.2239C＞T突变发生于TK末端，产生了一个缺失TK末端以及富含丝氨酸/苏氨酸和脯氨酸结构的截短蛋白。目前国内外上发现的ROR2突变多是8、9号外显子上无义突变或移码突变导致的截短蛋白或产生的异常C末端。表1总结了国内外有关ROR2基因突变导致BDB1的突变位点。

表1 导致BDB1的ROR2基因突变位点统计

由ROR2基因突变导致BDB1的分子机制并不清楚。Takeuchi等［24］发现小鼠ROR2基因杂合缺失突变没有表型。Oldridge等［3］发现两个染色体9q22杂合缺失的患者并没有表现出短指症状。这些研究说明BDB1的发病是由于ROR2特定位置突变产生了致病的蛋白，而非单纯的由于蛋白质单倍型剂量不足所致［3］。本研究报道的ROR2c.2239C＞T突变导致mRNA上出现了提前终止密码子（premature termination codon，PTC），但由于该突变发生在第9号外显子上，翻译后产生了较长的多肽链，可能发生了无义介导的mRNA降解（nonsensemediated mRNA decay，NMD）逃逸，从而产生了有害的ROR2截短蛋白。研究表明，Wnt5a作为ROR2蛋白的配体，能够与ROR2的CRD结合，Wnt5a/ROR2通路可通过激活SOX9促进β-catenin降解，从而拮抗典型的Wnt信号通路参与软骨形成，在肢体骨骼发育和形态发生中发挥重要作用［25］。此外，ROR2蛋白胞内区的PR和ST2可以和细丝蛋白A（Filamin A，FLNa）相结合，从而激活Wnt5a/ROR2/JNK信号通路诱导软骨细胞的增殖和极性细胞迁移［26］。这些结果表明ROR2基因的突变可能通过上述通路信号传导异常导致BDB1的发生。

综上所述，本研究通过对1个湖北汉族BDB1家系进行突变鉴定，发现了ROR2c.2239C＞T突变可导致ROR2基因编码的氨基酸序列上第747位精氨酸错义终止，形成截短蛋白。这一新的突变丰富了国际BDB1疾病的基因突变谱，结合以往我们报道的在3个湖北省BDB1家系中ROR2的另一个终止突变，提示ROR2基因的终止突变可能是湖北省BDB1疾病的主要致病基因突变。