子痫前期患者血小板促凝亚群形成水平升高*

褚雅歆，刘佳新，杨静，郭晗，张云聪，杨硕，乔蕊（1.北京大学第三医院a.检验科，b.妇产科，北京 100191；.北京积水潭医院检验科，北京 100035）

子痫前期（preeclampsia，PE）是严重影响母婴健康的妊娠并发症，以妊娠20周后新发高血压（≥140/90 mmHg）和蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h）为特征，可迅速进展至危及生命的子痫［1］。目前除终止妊娠外，PE尚无其他有效治疗措施［2］。虽然PE发病机制尚不明确，但是胎盘缺血-再灌注损伤通常会导致母体全身血栓-炎症反应综合症［3-4］——使母体出现广泛的血管内皮功能障碍和止血系统过度激活。小剂量阿司匹林（100～150 mg/d）抗血小板治疗是目前唯一被证明具有PE预防作用的措施［5］，提示血小板激活在PE母体血栓-炎症反应的发生或进展中可能发挥着重要作用。

血小板在激活后形成的血小板促凝亚群可以大量释放同时具有促炎症和促凝作用的血小板微粒（platelet microparticle，PMP）［6-9］，所以该群血小板极有可能参与了PE母体全身血栓-炎症的发生或进展过程。因此，为了证明PE发生过程中，血小板激活是否会形成异常升高的促凝亚群，本研究首先利用流式细胞术构建了血小板促凝亚群检测方法，进而探索了血小板促凝亚群形成在PE和正常妊娠过程中的水平差异。

1 对象和方法

1.1 研究对象 自2020年10月至2021年6月，连续入选北京大学第三医院健康育龄女性49例，健康孕妇39例，PE孕妇34例。PE诊断符合《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》诊断标准［10］。排除患有妊娠期高血压、慢性高血压、心脏病、糖尿病、自身免疫病、阑尾炎、胆囊炎和胰腺炎等疾病的患者。本研究已通过医院伦理委员会批准（批准文号：IRB00006761），研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 扫描电子显微镜（日本电子公司）；大容量台式离心机（美国Thermo FIsher Scientific公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司），CantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）；共聚焦培养皿（美国MatTek公司）。

I型胶原、凝血酶、Gly-Pro-Arg-Pro amide（GPRP）、PBS缓冲液、前列腺素E1（美国Sigma公司）；流式细胞管、FITC-Annexin V、PE-Cy7 CD41a抗体、PE-Cy7 IgG1κ同型对照（美国BD公司）；PE-CD62P抗体、PE-CD62P IgG1κ同型对照（美国Biolegend公司）；Cy5-GSAO、Cy5-GSCA（北京博奥森公司）；PGE1（美国MCE公司）。

1.3 体外激活血小板成为促凝血小板的反应条件 采集5名健康育龄女性志愿者新鲜全血，在室温条件下，即刻分别用不同浓度的胶原（2、5、10、12及15μg/mL）和凝血酶（0.1、0.2、0.5、1、2 U/mL）激活血小板（终浓度：2×109/mL），以确定体外激活血小板形成促凝血小板的适宜反应条件。

1.4 利用扫描电镜检测促凝血小板形成 采集新鲜全血，0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝（抗凝剂∶全血＝1∶9），在室温、230×g条件下离心5 min，获取富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP），将PRP加入包被有胶原及凝血酶的共聚焦培养皿温育60 min，洗涤及干燥处理后于电镜下观察。

1.5 利用流式细胞术构建促凝血小板检测方法

1.5.1 采用全血作为样本检测促凝血小板 即刻检测枸橼酸钠抗凝血：设置同型对照管、CD41a单阳管、CD62P单阳管、GSAO单阳管，每份血小板分为静息组、激活处理2个组。除静息组外，分别向各管加入激活剂及相应荧光抗体，室温温育15 min后洗涤，上机检测。设门方案：首先，调节流式细胞仪电压及补偿，在FSC-SSC图中圈定血小板大小所在位置，见图1A中P1区域；其次，利用血小板特异表达CD41a圈出血小板，图1B中P2区域；最后，通过PE-CD62P和Cy5-GSAO圈定血小板促凝亚群，见图1C中Q2区域。

1.5.2 采用洗涤血小板作为样本检测促凝血小板 室温条件下，枸橼酸钠抗凝血中加入前列腺素E1，离心（230×g，7 min）获得PRP，再次离心（300×g，5 min）获得血小板。洗涤血小板的染色处理程序、设门方案同上述全血，见图1D～1F。

图1 利用流式细胞术构建促凝血小板检测方法

1.5.3 检测所构建促凝血小板检测方法的精密度 采集一名健康育龄女性志愿者静脉血3 mL，枸橼酸钠抗凝，利用上述构建的2种方法连续测定5次，计算变异系数（coefficient variation，CV）。

1.6 研究对象血小板激活成为促凝血小板的比例 采集研究对象静脉血，枸橼酸钠抗凝，用1.5方法检测研究对象血小板激活成为促凝血小板的比例并分析。

1.7 统计学分析 分别用SPSS 20.0和Graphpad prism 5软件进行统计学分析和绘图。流式细胞术检测促凝血小板的精密度评价以CV表示。符合正态分布的数据用±s表示，不符合正态分布的数据用M（P25，P75）表示，采用Kruskal-WallisH检验进行多组间比较。促凝血小板对PE的鉴别效能用ROC曲线分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外激活血小板成为促凝血小板的反应条件 在2～15μg/mL胶原浓度范围内和在0.1～2 U/mL凝血酶浓度范围内，血小板激活成促凝血小板的比例都逐渐升高，见图2；用15μg/mL胶原和2 U/mL凝血酶联合激活产生的促凝血小板水平高于2种激活剂单独激活时水平，见表1。为了使流式细胞术构建的促凝血小板检测方法具有足够精密度，选择15μg/mL胶原和2 U/mL凝血酶联合激活，作为体外检测血小板激活形成促凝血小板能力的激活条件。

图2 不同浓度胶原和凝血酶激活血小板成为促凝血小板的水平

表1 不同诱导剂诱导血小板成为促凝血小板亚群的比例（n＝5）

2.2 扫描电镜下血小板激活后的形态 见图3。用15μg/mL胶原及2 U/mL凝血酶作为激活剂，在体外激活健康育龄女性的血小板，在扫描电镜下可以观察到3种不同形态的血小板，分别为静息血小板、聚集血小板亚群和促凝血小板亚群。

图3 扫描电镜下血小板激活后的形态

2.3 流式细胞术检测促凝血小板精密度验证 利用全血在静息、激活状态下检测促凝血小板的精密度分别为10.11%和3.13%；利用洗涤血小板在静息和激活状态下检测促凝血小板的精密度分别为12.86%和6.75%。见表2。

表2 利用流式细胞术构建促凝血小板检测方法的精密度（n＝5）

2.4 研究对象人口学特征及临床资料 研究对象人口学特征和临床资料见表3，3组间年龄差异无统计学意义（P＞0.05）；PE组和健康妊娠组怀孕期间增加体重、孕次、产次和孕周差异均无统计学意义（P均＞0.05）。计学意义［5.25%（4.13%，6.30%）vs 4.30%（3.70%，5.50%），P＝0.152］；血小板被激活后，PE孕妇组促凝血小板水平也高于健康育龄女性组［19.25%（15.98%，24.08%）vs 13.20%（11.55%，15.70%），P＜0.001］和健康妊娠孕妇组［19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］。

表3 研究对象人口学特征及临床资料

进行ROC分析显示，采用全血样本，在静息状态下，ROC曲线下面积（AUCROC）为0.951（0.908～0.994），当cut-off值为1.65%时，区分健康孕妇和PE的敏感性和特异性分别为97.1%和84.6%；在激活状态下，AUCROC为0.993（0.978～1.000），当cut-off值为12.35%时，区分健康孕妇和PE的敏感性和特异性分别为100.0%和97.4%；而洗涤血小板在激活状态下，AUCROC为0.691（0.563～0.819），当cut-off值为18.25%时，区分健康孕妇和PE的敏感性和特异性分别为61.8%和76.9%，见图4。

图4 采用不同样本类型检测促凝血小板区分正常妊娠和PE的性能

2.5 各组研究对象血小板激活成为促凝血小板比例的差异比较 采用全血作为检测样本，血小板在静息状态下，PE孕妇组促凝血小板水平高于健康妊娠女性组［2.30%（1.90%，2.80%）vs 1.35%（1.13%，1.50%），P＜0.001］和健康育龄女性组［2.30%（1.90%，2.80%）vs 0.30%（0.20%，0.60%），P＜0.001］；血小板被激活后，PE孕妇组促凝血小板水平也高于健康妊娠女性组［16.90%（15.25%，18.85%）vs 8.50%（7.92%，9.50%），P＜0.001］和健康育龄女性组［16.90%（15.25%，18.85%）vs 3.70%（2.95%，4.30%），P＜0.001］。

采用洗涤血小板作为检测样本，血小板在静息状态，PE孕妇组促凝血小板水平高于健康育龄女性组［5.25%（4.13%，6.30%）vs 2.50%（2.20%，2.90%），P＜0.001］，但与健康妊娠女性组差异无统

3 讨论

本研究利用流式细胞术成功构建了可靠的促凝血小板检测方法，并且对入组的健康育龄女性、健康妊娠孕妇和PE孕妇进行了促凝血小板检测，结果提示PE孕妇血小板激活后成为促凝血小板水平显著高于健康妊娠孕妇。

3.1 基于促凝血小板是血小板的一种死亡方式构建促凝血小板检测方案 细胞在经历坏死过程时，其线粒体膜上的mPTP的开放，随后细胞内部形成超高的Ca2+流，与细胞坏死过程相似，血小板促凝亚群的形成过程中同样伴随mPTP的开放以及细胞内部的超高Ca2+流［9-13］；除此之外，在电子显微镜下观察到血小板促凝亚群的关键形态特征类似于哺乳动物有核细胞所表现的坏死特征，例如，细胞膜上PS转移至细胞膜外侧，细胞微泡化以及细胞膜完整性丧失［14］。所以，血小板促凝亚群是经历坏死过程的血小板。4-（N-（S-谷胱甘肽乙酰基）氨基）苯胂酸［4-（N-（S-glutathionylacetyl）amino）phenylarsonous acid，GSAO］是细胞坏死的标志物，研究人员在GSAO的γ-谷氨酰基残基上标记荧光报告基团，利用它作为标志物成功检测到了血小板促凝亚群［15-19］。

除去坏死特征，血小板促凝亚群也是激活的血小板。血小板受到激活剂刺激后，CD62P大量转移至血小板膜上，是血小板激活的标志物［20］。因此，本研究采用CD62P以及GSAO同时定义血小板促凝亚群，成功利用全血和洗涤血小板作为样本构建了血小板促凝亚群的检测方案。

3.2 PE的炎症反应状态可能导致血小板在体内预激活 本研究结果显示，PE孕妇的促凝血小板水平均显著高于健康妊娠孕妇，这可能是由于PE孕妇存在更高的炎症反应状态，容易导致静息血小板在体内预激活。

促凝血小板形成的前提是胞浆Ca2+水平持续升高，当血小板处于高炎症环境时，促炎症因子（如肿瘤坏死因子α）、黏附分子等增加，可通过复杂的机制导致血小板胞浆Ca2+升高，即血小板在炎症状态下可能被预激活，在受到激活刺激后就会更容易形成形成促凝血小板［21］。这与本研究结果一致：利用全血在静息状态下检测的PE孕妇血小板促凝亚群水平显著高于健康妊娠孕妇［2.30%（1.90%，2.80%）vs 1.35%（1.13%，1.50%），P＜0.001］（洗涤血小板可能由于样品制备过程因素导致组间无差异）；在利用激活剂激活后，利用全血以及洗涤血小板作为样本，PE组的血小板促凝亚群水平自然也均显著高于健康妊娠孕妇组［16.90%（15.25%，18.85%）vs 8.50%（7.92%，9.50%），P＜0.001；19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］。

3.3 促凝血小板检测采用全血方案优于洗涤血小板方案的原因 本研究结果显示，采用全血检测方案在检测精密度和区分PE孕妇与健康妊娠孕妇时都显示了优越性。

首先，全血方案的样本处理程序简单导致检测的变异因素少。利用全血在静息、激活状态下检测促凝血小板的精密度分别为10.11%和3.13%；而利用洗涤血小板在静息和激活状态下检测促凝血小板的精密度分别为12.86%和6.75%，提示采用洗涤血小板可能因为多次离心、洗涤导致检测过程中影响因素增多，导致了检测不确定度增加。

其次，血小板洗涤程序可能外源性增加了血小板的预激活程度，使PE组和健康妊娠组的差异缩小，区分PE孕妇和健康孕妇的能力下降。利用全血作为样本，健康妊娠孕妇和PE孕妇的比较无论在静息［1.35%（1.13%，1.50%）vs 2.30%（1.90%，2.80%），P＜0.001］或是激活状态［8.50%（7.92%，9.50%）vs 16.90%（15.25%，18.85%），P＜0.001］差异均有统计学意义；而利用洗涤血小板进行检测，只有在激活状态下，PE的促凝血小板水平显著高于健康妊娠孕妇［19.25%（15.98%，24.08%）vs 16.50%（15.00%，17.50%），P＝0.047］，且差异程度不及采用全血样本显著；并且静息状态下两组没有差异［5.25%（4.13%，6.30%）vs 4.30%（3.70%，5.50%），P＝0.152］，这提示洗涤血小板的制备过程中可能导致了血小板预激活，使原本差异小的静息状态下的差异消失，激活状态下的差异变小。ROC曲线分析显示，用全血检测，在静息和激活状态下检测促凝血小板区分PE和健康妊娠的AUCROC分别为0.951和0.993；而利用洗涤血小板检测，在激活状态下，其ROCROC只有0.691，这表明采用全血检测的区分PE孕妇和健康孕妇的能力明显好于洗涤血小板。

综上所述，利用流式细胞术成功构建促凝血小板检测方法，其中采用全血检测的方案性能优于洗涤血小板检测方案。PE孕妇促凝血小板形成水平显著高于健康妊娠孕妇，提示促凝血小板可能参与PE发生。