CD38和p90RSK/CREB/Bcl-2信号通路在丙泊酚预处理星形胶质细胞减轻谷氨酸神经毒性中的作用*

肖 飞，李春来,2，覃银莹，陈 静，关睿聪，谢玉波,2，钟 妤

（1.广西医科大学第一附属医院麻醉科，南宁 530021；2.广西消化道肿瘤加速康复外科基础研究重点实验室，南宁 530021）

谷氨酸是体内一种重要的神经递质，能够维持大脑活动的兴奋性，与神经元和胶质细胞的增殖、发育、存活及死亡密切相关，但其在体内浓度过高时可产生兴奋性神经毒性[1]。有研究表明谷氨酸的神经毒性与多种脑损伤的发生、发展密切相关[2]。人白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）38是哺乳动物体内最主要的一种二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）核糖基环化酶，可以催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）向环腺苷二磷酸核糖（cyclic ADP-ribose，cADPR）转化，cADPR作为第二信使在细胞之间的信号转导中起重要作用[3-4]。p90RSK/CREB/Bcl-2信号通路，具有促进细胞存活和炎症修复的作用，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可以激活p90RSK，后者激活环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）并诱导B 细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的产生[5]。本课题组前期的研究发现，谷氨酸可能通过抑制p90RSK/Bcl-2信号通路产生神经毒性[6]，谷氨酸是否通过p90RSK/CREB/Bcl-2 信号通路产生神经毒性，目前尚不清楚。有研究报道丙泊酚可以通过降低兴奋性神经递质的浓度从而产生脑保护作用[7]。丙泊酚减轻谷氨酸神经毒性的具体机制尚不清楚。本研究拟通过丙泊酚预处理星形胶质细胞，并用其培养基孵育大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞系，进一步探讨谷氨酸神经毒性的作用机制并寻找有效的抗谷氨酸神经毒性的药物，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 丙泊酚（批号：10KC3900，Corden Pharma 公司，意大利）；兔抗大鼠p90RSK 单克隆抗体、p-CREB 单克隆抗体、Bcl-2 单克隆抗体和β-Tubulin 单克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）；山羊抗兔HR-IgG（Santa Cruz 公司，美国）；Annexin V-PI 凋亡检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，中国）；ATP、ROS 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；CD38-siRNA（生工生物工程股份有限公司，中国）；转染试剂（上海徕创生物科技有限公司，中国）；PC12 细胞系（国家实验细胞资源共享服务平台，中国）。

1.2 实验分组及处理 按照随机数字表法将PC12细胞分为4组：对照组（C组）、谷氨酸组（G组）、丙泊酚预处理组（PG 组）、CD38 基因沉默组（CPG 组）。C 组即为正常培养的PC12 细胞；G 组用3.5 mmol/L谷氨酸孵育PC12细胞6 h；PG组先用100 μmol/L丙泊酚预处理星型胶质细胞6 h，并将其培养基加入谷氨酸干预PC12细胞中；CPG组先用CD38-siRNA沉默星形胶质细胞CD38 基因，再用100 μmol/L 丙泊酚预处理星型胶质细胞6 h，并将其培养基加入谷氨酸干预PC12细胞中（同PG组）。

1.3 分离和提取星形胶质细胞 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性SD 大鼠，1 日龄，体重5～7 g，超净工作台中断头取脑，取出双侧大脑皮质，除去脑膜和血管，用眼科镊将其剪成1 mm3大小的组织块，通过胰蛋白酶和胶原酶消化成为单细胞悬液，即为星形胶质细胞悬液（所有操作均在冰上进行）。将细胞转移到含有10%胎牛血清+89%的DMEM-F12+1%青链霉素的培养皿中，在37 ℃，5%CO2温箱中培养。

1.4 siRNA转染CD38并筛选出最适浓度 将序列为5’-CUCAAACCAUACCAUGUAA-3’的siRNA与转染试剂按照说明书混合后，加入细胞培养皿，并轻轻混匀，24 h 后更换培养基，转染48 h 后检测CD38mRNA 或CD38 蛋白表达，并选出CD38-siRNA 的最适转染浓度。转染成功后，取统一转染条件的星形胶质细胞备用。

1.5 ROS试剂盒测定各组ROS的含量 各组PC12细胞用相应的药物处理后，按照ROS试剂盒操作说明进行后，使用荧光酶标仪检测各组细胞的荧光强弱（激发波长设置为488 nm，发射波长设置为525 nm）。

1.6 ATP 试剂盒测定各组ATP 的含量 各组PC12细胞用相应的药物处理后，按照ATP试剂盒操作说明进行后，使用化学发光仪检测各组相对光子强度（relative light unit，RLU）。

1.7 蛋白质免疫印迹（Western blotting）法测定PC12 细胞p90RSK、p-CREB 和Bcl-2 蛋白的表达各组PC12 细胞用相应的药物处理后，加入适量细胞裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制剂=98∶1∶1）提取总蛋白，采用BCA 法进行蛋白定量，并与上样缓冲液混匀、煮沸。各组取适量蛋白加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳，转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h。TBST 漂洗3 次，每次5 min，分别加入兔抗大鼠p90RSK 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗大鼠p-CREB单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体（1∶1 000）或β-Tubulin（1∶5 000），4 ℃摇床孵育过夜。TBST漂洗3次，每次5 min，加入羊抗兔HR-IgG 抗体（1∶5 000），常温摇床孵育1 h。使用Odyssey（LI-COR 公司，美国）扫膜仪扫膜，应用Image Lab软件进行分析灰度值，以目的蛋白条带灰度值与或β-Tubulin 条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平。

1.8 流式细胞术检测各组PC12细胞凋亡情况 按照Annexin V-PI 细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行：加入适量Binding Buffer、重悬细胞、FITC Annexin V与PI 混匀、室温下避光反应5～15 min 后待上机检测。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞ROS含量的变化 与C组比较，G组细胞ROS 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与G组比较，PG组细胞ROS含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PG 组比较，CPG 组细胞ROS含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组ROS含量的变化

2.2 各组细胞ATP含量的变化 与C组比较，G组细胞ATP 含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与G 组比较，PG 组细胞ATP 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PG组比较，CPG组细胞ATP含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组ATP含量的变化

2.3 各组p90RSK 蛋白、p-CREB 蛋白和Bcl-2 蛋白表达的变化 与C 组比较，G 组p90RSK 蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表达下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与G 组比较，PG 组p90RSK 蛋白、p-CREB 蛋白和Bcl-2 蛋白表达上调，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与PG 组比较，CPG 组p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表达下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图3。

图3 Western blotting检测各组p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白水平比较

2.4 各组PC12 细胞凋亡情况 与C 组比较，G 组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与G 组比较，PG 组细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PG 组比较，CPG 组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 各组PC12细胞凋亡率比较

3 讨论

谷氨酸是体内一种重要的兴奋性神经递质[1]，在中枢神经系统的发育过程中起着至关重要的作用[8]。当体内谷氨酸大量释放和堆积时，可产生兴奋性神经毒性，造成神经细胞坏死或凋亡[9]。丙泊酚是一种起效快，持续输注无蓄积的静脉麻醉药。本课题组前期研究发现丙泊酚可降低兴奋性神经递质的浓度，减轻谷氨酸的神经毒性，产生脑保护作用[6]。本研究通过应用丙泊酚及沉默CD38基因，发现丙泊酚减轻谷氨酸的神经毒性可能与CD38和p90RSK/CREB/Bcl-2信号通路有关。

p90RSK/CREB/Bcl2 信号通路在神经元的分化、发育、生存和凋亡等生理过程中发挥重要作用[5]。本实验结果显示，当给予谷氨酸时，PC12细胞的ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表达降低，ROS含量及细胞凋亡率上升。当加入丙泊酚预处理星形胶质细胞的培养基时，ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表达上升，ROS 含量和细胞凋亡率降低。提示谷氨酸可能通过抑制p90RSK/CREB/Bcl-2 信号通路产生神经毒性，丙泊酚可能通过激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信号通路，减轻谷氨酸的神经毒性。

CD38 是一种ADP 核糖基环化酶，神经系统内主要存在于星形胶质细胞的细胞膜，可以催化胞外氧化NAD+向细胞内cADPR 转化，导致Ca2+从内质网释放到细胞质，触发F-肌动蛋白的构象改变，细胞骨架重塑，促进质膜的内陷及外凸作用[10-12]，而细胞质膜的内陷及外凸作用与细胞的胞吞胞吐有关。本研究结果显示，当沉默CD38基因后，再将丙泊酚处理星形胶质细胞的培养基加入谷氨酸干预PC12细胞中，ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2 蛋白表达降低，ROS 含量及凋亡率升高。说明CD38蛋白在丙泊酚预处理星形胶质细胞减轻谷氨酸的神经毒性中发挥重要作用。

本课题组前期研究表明丙泊酚可以激活星形胶质细胞膜上的CD38蛋白，从而使内质网内的Ca2+释放到细胞质。有研究发现星型胶质细胞可以释放功能性线粒体至神经元，从而修复受损的神经元[13]，而星型胶质细胞释放线粒体由Ca2+依赖的CD38/cADPR信号通路介导[14-15]。由此推测：丙泊酚预处理星形胶质细胞减轻谷氨酸的神经毒性可能是通过激活星形胶质细胞膜上的CD38 蛋白，导致星形胶质细胞内的钙大量释放到细胞质，触发F-肌动蛋白的构象改变，细胞骨架重塑，促进质膜的外凸作用，从而释放功能性线粒体至神经元，激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信号通路，修复受损的神经元，减轻谷氨酸的神经毒性。

综上所述，谷氨酸的神经毒性可能和p90RSK/CREB/Bcl-2信号通路有关，而丙泊酚可能通过激活星形胶质细胞膜上的CD38 蛋白，激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信号通路，修复受损的神经元，从而减轻谷氨酸的神经毒性。而星形胶质细胞是否通过释放功能性线粒体来激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信号通路，仍需进一步实验验证。