组蛋白去乙酰化酶9在香烟烟雾暴露所致肺气肿小鼠中的作用*

谢 婷，郑桂贤，霍增榆，韦鑫燕，黄颜冰，陈小丽，白 晶

（广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症学科，南宁 530021）

肺气肿是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）主要的病理特征，是COPD 发病机制的研究重点，通过建立肺气肿动物模型是众多学者研究COPD 公认的有效方法[1]。吸烟是肺气肿发展主要的危险因素，香烟烟雾中含有焦油、尼古丁、氢氰酸等多种有害成分，这些有害物质可直接作用于呼吸道，长期吸烟可导致肺内异常炎症反应，损害支气管和肺泡上皮细胞，导致肺功能下降，从而使肺气肿发病率增加。调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）参与控制免疫与炎症反应，在自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病中起重要作用[2]，叉头状转录因子p3（forkhead box P3，Foxp3）是控制Treg 细胞发育和功能的关键因子。有研究表明，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）与调节性T细胞免疫抑制功能相关，HDAC9在此过程中起关键作用[3]。本研究构建HDAC9 基因缺失小鼠与野生型小鼠肺气肿模型，观察HDAC9 在香烟烟雾暴露所致肺气肿小鼠中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器 HDAC9-/-C57BL/6 小鼠与野生型小鼠，鼠龄6 周，雄性，体重（20±2）g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，动物使用许可证号：SYXK（沪）2017-0012。真龙牌香烟（武汉烟草公司，焦油量10 mg，烟碱量1.0 mg）。CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit、分选柱（Miltenyi，德国）；Foxp3 抗体（Novus，美国）；Percp-Cy5.5-anti-mouse-CD4 及PE-anti-mouse-CD25 (BD Pharmingen,美国)；逆转录试剂盒、荧光定量扩增试剂盒（Takara公司，日本）。BX51正置显微镜（Olympus 公司，日本）；BD FACSVerse 流式细胞仪（BD Pharmingen,美国）；Applied Biosystems 7500 型荧光定量PCR仪（ABI，美国）。

1.2 动物模型建立 自制两个玻璃舱，分别标为A、B 两舱，将野生型烟熏组与HDAC9-/-烟熏组置于A 舱中进行香烟烟雾暴露建立肺气肿模型，每次同时点燃5只香烟，40 min后开舱通气20 min，每天重复4次，每周烟熏5 d，连续24 周。将野生型对照组与HDAC9-/-对照组置于B 舱中呼吸新鲜空气，其余饲养条件完全同烟熏组。

1.3 肺组织病理学观察 用10%甲醛固定左肺，石蜡包埋后进行切片及HE染色。显微镜下（×200）观察每张切片肺部情况，随机选取5个视野并拍照。

1.4 免疫磁珠分选脾脏中Treg 细胞 取小鼠脾脏于200目滤网中研磨成后离心5 min，弃上清后加入红细胞裂解液，离心洗涤获得单个核细胞。依次加入适量的Biotin-Antibody cocktail、Anti-Biotin MicroBeads、CD25-PE antibody、Anti-PE MicroBeads，经LD 柱阴选和MS 柱阳选后得到CD4+CD25+Treg细胞，使用CD4及CD25流式抗体进行染色，经流式细胞仪检测，该类细胞纯度达90%以上。

1.5 免疫组织化学法检测小鼠肺组织Foxp3 蛋白的表达 左肺石蜡切片，脱蜡后免疫组化染色。阳性表达呈棕黄色，Foxp3 表达在胞核或胞质中。显微镜下（×200）观察每张切片，随机选取5个视野，使用Image-Pro plus 软件分析积分光密度（integrated optical density，IOD）比值。

1.6 实时荧光定量聚合酶连式反应（RT-qPCR）法检测Treg 细胞中HDAC9mRNA 表达及肺组织中IL-1βmRNA 表达 Trizol 法提取总RNA，先逆转录，随后在荧光定量PCR仪上进行扩增。以β-Actin为内参，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。引物序列如下，β-Actin上游：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’；HDA-C9上游：5’-TGCATCGGAAGCCTGCATAA-3’，下游：5’-CGTATTCACGGACTGGTGGAGA-3’；IL-1β上游：5’-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游：5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’。

1.7 统计学方法 采用SPSS 24.0 进行统计分析，正态分布资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺组织病理学变化 显微镜下可见野生型对照组与HDAC9-/-对照组肺泡结构正常，无炎症细胞浸润；野生型烟熏组气道壁和肺泡间隔可见炎细胞增多，肺泡壁断裂明显，肺泡腔扩大；HDAC9-/-烟熏组肺泡间隔部分断裂，但较野生型烟熏组减轻，未见明显炎细胞浸润。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理学变化（HE，×200）

2.2 Treg 细胞纯度的检测及小鼠Treg 细胞中HDAC9mRNA的表达情况 免疫磁珠分选小鼠脾脏的CD4+CD25+Treg 细胞，纯度达90%以上。RTqPCR结果显示：与野生型对照组比较，野生型烟熏组Treg 细胞中HDAC9的mRNA相对表达量增高（P＜0.01）。见图2和图3。

图2 CD4+CD25+Treg细胞纯度检测

图3 Treg细胞中HDAC9 mRNA表达水平

2.3 各组小鼠肺组织Foxp3 蛋白的表达情况 阳性表达呈棕黄色。与野生型对照组比较，野生型烟熏组肺组织中Foxp3 表达减少，HDAC9-/-对照组Foxp3 表达增多（均P＜0.01）；与HDAC9-/-对照组比较，HDAC9-/-烟熏组Foxp3表达减少（P＜0.01）；与野生型烟熏组比较，HDAC9-/-烟熏组Foxp3 表达增多（P＜0.01）。见图4。

图4 各组小鼠肺组织Foxp3蛋白表达比较

2.4 各组小鼠肺组织IL-1βmRNA的表达情况 与野生型对照组比较，野生型烟熏组肺组织中IL-1βmRNA的表达量增高（P＜0.01）；与野生型烟熏组比较，HDAC9-/-烟熏组肺组织中IL-1βmRNA的相对表达量降低（P＜0.01）。见图5。

图5 各组小鼠肺组织IL-1β mRNA的表达情况

3 讨论

香烟烟雾是肺气肿的主要危险因素，本实验以长期香烟烟雾暴露建立小鼠肺气肿模型，显微镜下观察小鼠小气道和肺部病理表现，烟熏组肺组织中可见气道壁和肺泡间隔炎症细胞浸润，肺泡壁断裂明显，相邻肺泡融合，肺泡腔扩大，表现出明显的肺气肿改变。白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）属于白细胞介素-1 家族，由单核细胞、巨噬细胞等分泌，可招募炎症细胞至感染部位,引发炎症反应和组织损伤。有研究报道，与非吸烟者比较，肺气肿患者肺组织和痰中IL-1β水平显著升高，提示IL-1β参与气道炎症和肺气肿的进展[4]。

调节性T细胞是一类控制体内免疫反应的T细胞亚群，在维持天然免疫耐受和调控自身免疫性疾病中起重要作用。Foxp3是调节性T细胞的特异性转录因子，在控制天然Tregs 的发育和功能中起关键作用[5]。有研究发现，与健康人相比，肺气肿患者肺组织内Treg 细胞数量减少，且Foxp3 的显著减少[6]。此外，有研究报道，与不吸烟者相比，肺气肿患者的肺泡灌洗液中出现Treg 细胞数量下调[7]。Isajevs 等[8]研究也发现，与不吸烟健康人和吸烟肺功能正常人相比较，肺气肿患者小气道中Foxp3 表达减少。大量的研究提示调节性T细胞可能参与肺气肿的发生发展。

组蛋白乙酰化和去乙酰化在调控真核细胞基因表达中起重要作用，参与调节慢性炎症性肺病[9]。本课题组前期研究表明HDACs 参与介导肺气肿中Treg细胞免疫抑制功能，进一步在肺气肿的发生发展中起作用[10]。尽管Treg 细胞表达多种HDAC，但研究表明HDAC9 在Treg 细胞功能和发育中尤为重要[11]。有研究报道，与野生型小鼠相比，HDAC9基因敲除小鼠体内CD4+Foxp3+Treg细胞数量增加和抑制功能增强[12]。本课题组的研究也表明在香烟烟雾诱导的小鼠肺气肿模型中Treg 细胞功能失调可能与Treg细胞中HDAC9表达增多有关。

本研究结果显示，HDAC9-/-烟熏组肺组织中Foxp3 的表达量增多，而IL-1β 炎症介质表达减少，肺泡间隔部分断裂，但肺气肿改变较野生型烟熏组减轻。结果提示在HDAC9-/-烟熏组肺组织中，Foxp3+Treg 细胞增多可能进一步参与肺气肿改善。因此，本课题组推断敲除HDAC9可增强调节性T细胞数量和功能，参与介导香烟烟雾暴露所致的肺气肿情况改善，为其治疗提供一个潜在的靶点。