黄瓜疫霉菌拮抗内生细菌的筛选与鉴定

郑 京，梁乐霞，宣倩倩，郭慧滢，周志国，孙泽敏，左国才

（1.廊坊师范学院生命科学学院，河北 廊坊 065000；2.北京理工大学生命学院，北京 100081）

【研究意义】疫霉菌在全球广泛分布，包括一些破坏性侵染重要作物和森林的毁灭性病原体。卵菌纲霜霉目腐霉科疫霉属Phytophthora［1-2］是植物病原菌中危害最大的属之一，其中肉桂疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）是世界上最具毁灭性的植物病原菌之一［3-4］。本研究涉及到的掘氏疫霉菌（Phytophthora drechsleri）具短绒毛状气生菌丝体，这种气生菌丝体能够引起黄瓜疫病（Epidemic Disease，简称ED）的发生。ED 是一种土传病害，具有较强的毁灭性。黄瓜在感染掘氏疫霉菌后，发病凶猛，扩散迅速，在世界范围内引起严重危害，然而利用植物内生菌（endophyte）与植物的互作可以防治这种病害。植物内生菌是微生物学和植物微生态学的交叉研究领域，有着很好的发展前景。目前“资源节约，环境友好”已经成为产业发展主流，植物内生菌的研究已经成为生态农业发展的重要方向，该领域的相关研究成果不仅在微生物基础研究方面具有十分重要的理论价值，而且在解决人口过快增长、资源短缺、环境污染和农业可持续性发展等方面也具有重要的实践意义。

【前人研究进展】20 世纪40 年代末，日本的黄瓜被一种疫霉菌所侵染，发生了脚腐病，经Katsura 实地仔细观察和深入研究，将该疫霉菌认定为一种霉菌新种（命名为Phytophthora melonisKatsura）。1970 年代，我国的黄瓜也大面积遭遇疫病，南京农学院植物病理教研组陆家云等对侵染我国黄瓜的疫霉属真菌进行了生物学及分类学研究，表明Phytophthora melonis和Phytophthora drechsleri之间的差异极小，只是Phytophthora melonis的致病性仅限于葫芦科植物，因此认为可以将原来在黄瓜上鉴定的病原菌重新鉴定为Phytophthora drechsleri［5］。之后便有研究者开始利用生物方法防治由该病原菌引起的疫病。Kim等从土壤中分离得到176 株菌株，其中49 株对Phytophthora drechsleri有拮抗作用，最明显的为肠杆菌Enterobacter asburiae［6］。疫霉菌通常有着广泛的寄主，除黄瓜外还有辣椒、大豆等。有研究者将多粘类芽孢杆菌进行固体发酵制成肥料用于防治辣椒疫霉病［7］。也有研究者从基因水平上筛选出抗大豆疫霉病的基因，种植含有抗病基因的大豆品种从而预防大豆疫病的发生［8］。

【本研究切入点】21 世纪以来，生物防治逐渐成为热点。由于生存形式独特，植物内生菌逐渐被专家们广泛关注。通过后续深入研究发现，植物内生菌能产生水解酶、植物生长调节剂、抗菌物质等多种化合物，以增强植物抗病能力，促进植物快速生长［9-10］。植物内生菌还可使植物天然定殖，且能够在植物体内稳定生存下来。因此，利用植物内生菌这种手段会使防治效果更加稳定、持久且无污染。【拟解决的关键问题】本研究的植物内生细菌分离筛选自黄瓜叶片，通过平板对峙法和发酵液拮抗法筛选出对掘氏疫霉菌具有拮抗作用的内生细菌并对其进行鉴定。分析此内生细菌对掘氏疫霉菌的拮抗作用，为进一步开展理论研究和应用提供材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄瓜（中农26 号，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所研制）叶片于2021 年6 月25 日采自天津市武清区下朱庄。

掘氏疫霉，目前存于本实验室，于2021 年6 月15 日由北京理工大学生命学院冯永君先生惠赠。

NA 培养基：1.5 g 牛肉膏、5.0 g 蛋白胨、7.5 g NaCl，加入去离子水定容至500 mL，调节pH 值至7.2～7.4，加入7.5 g 琼脂混匀；121℃条件下蒸汽灭菌20 min。

PDA 培养基：100.0 g 除去表皮的马铃薯块、10.0 g 葡萄糖、7.5 g 琼脂，加去离子水至500 mL；115℃、0.1 MPa 条件下蒸汽灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 内生菌的分离和初步鉴定 2021 年6 月27日于廊坊师范学院生命科学学院实验教学中心开始展试验。

取黄瓜叶片，清理表面并洗净吸干。对进行了初步处理的黄瓜叶片的表面完成相关消毒处理，具体操作为：（1）将浓度为75%的乙醇浸泡黄瓜叶片60 s；（2）将浓度为2.5%的次氯酸浸泡黄瓜叶片5 min；（3）将浓度为75%的乙醇冲洗黄瓜叶片30 s；（4）使用无菌水反复冲洗黄瓜叶片5 次；（5）为了检查黄瓜叶片表面是否已彻底消毒，取最后一次洗涤水100 μL，涂布到NA 平板；（6）在超净工作台中取经过处理的黄瓜叶片（对角线处）1 g 放入研钵，并且加入9 mL 无菌水，研磨至匀浆；（7）静置20 min 后，设置3 个试验处理，每个处理3 次重复，分别取100 μL 稀释液（按3 个稀释浓度梯度），涂布NA 平板后置于30 ℃恒温培养箱中2 d 左右。

根据待检菌株的镜检特征、革兰氏染色反应、菌落排列方式和菌落形态特征等进行初步筛选，筛选出存在比较明显差异的菌落，将筛选出的菌落采用平板划线法进行3 次纯化操作，纯化后，再使用甘油管进行冷冻，保存备用。

1.2.2 拮抗内生菌的筛选与拮抗作用测定 平板对峙法：取掘氏疫霉菌接种至PDA 平板，置于28 ℃恒温培养箱中48 h 左右，直至菌丝生长至铺满平板（达到生长旺盛），在平板边缘取直径为6 mm 的菌丝块，置于距离中央等距打有4 孔的空白PDA 平板中央，在其中的1 个孔中滴加NA 液体培养基100 μL 作为空白阴性对照，剩下3 孔作为试验处理，分别滴加100 μL 待测内生细菌培养液（1 × 108CFU/mL 浓度）；同时设置1 个中央接种菌丝块但不打孔接种待测细菌的空白PDA 平板作为掘氏疫霉菌菌丝生长距离的对照。在30 ℃恒温培养箱中培养，直至掘氏疫霉菌菌丝生长距离彻底满过对照孔并延伸至平板边沿，每个处理3 次重复，计算菌丝生长抑制率：

发酵液拮抗法：将待测菌株活化后接种至NA液体培养基中，恒温摇床培养（30℃，2.67 r/s）5 d 后，吸取适量培养液用过滤器（0.22 μm）过滤，在16 mL 温热的PDA 培养基中加入4 mL 滤液（同时作为阴性对照设置添加4 mL 无菌水处理）充分混合均匀后倒平板，在平板中央接种直径为6 mm的掘氏疫霉菌菌丝块，移入30 ℃恒温培养箱中倒置培养，每个处理3 次重复，计算抑菌率：

1.2.3 拮抗内生菌的分子鉴定

在液体NA 培养基中接种待测拮抗细菌，置恒温摇床（30℃，2.67 r/s）培养至对数生长期，取培养液利用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA 提取试剂盒提取细菌基因组DNA，以待测菌株基因组DNA 为模板，采用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 扩增其16S rDNA 序列。

PCR 反应体系：30 μL 2×PCR Buffer，引物各3 μL，9 μL DNA 模板，超净水补足至60 μL；PCR扩增程序如下：94℃ 10 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30 个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物回收后用pMD18-T载体进行T连接，提取重组质粒测序（苏州金唯智生物科技有限公司）。

将所获序列导入NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的BLAST 查询系统进行比对分析，用CLUSTAL_X 程序对目标菌株及相关菌株16S rDNA 序列进行处理获得ALN 文件，然后用MEGA 7 软件对ALN 文件进行转化，最后进行分类分析、数据距离度量和系统进化树的构建（邻域连接法Neighbor-Jioning，NJ）。

2 结果与分析

2.1 黄瓜叶内生菌的分离与初步鉴定

以黄瓜叶片为原材料，进行内生菌分离与纯化操作，根据待测菌株的镜检、革兰氏染色反应、菌落排列方式和菌落形态等差异，获得32 株内生细菌编号为CL1～CL3，其中革兰氏阴性杆菌10 株、革兰氏阳性杆菌13 株、革兰氏阳性球菌9 株。

2.2 掘氏疫霉菌拮抗内生菌的筛选

以分离得到的32 株黄瓜内生细菌为材料，利用平板对峙法进行相关拮抗试验，发现8 株对掘氏疫霉有较强抑制作用的拮抗菌株（表1），菌丝抑制率为10.3%～54.3%，抑菌半径为1～7 mm；抑菌效果较好的菌株有3 株分别为CL7、CL9 和CL15，抑菌半径及菌丝抑制率分别为：6 mm，45.2%；7 mm，54.3%；6 mm，40.2%。

表1 抗掘氏疫霉内生拮抗菌的抑菌半径和菌丝抑制率Table 1 Inhibition radius and mycelial inhibition rate of endophytic antagonists against Phytophthora drechsleri

图1 展示了具有较强抑制作用的3 株拮抗菌株，从图1 可以看出3 株拮抗菌均能有效抑制掘氏疫霉的生长。

图1 黄瓜内生细菌对掘氏疫霉平板对峙实验的结果Fig.1 Results of plate confrontation experiment of endophytic bacteria against Phytophthora drechsleri in cucumber

通过发酵液拮抗法实验，对菌株CL7、CL9、CL15 作进一步测定，结果表明，3 个菌株的发酵滤液均对掘氏疫霉有拮抗效果（图2），其中CL9 菌株发酵液对掘氏疫霉菌的抑菌率达到72.2%（表2）。

图2 CL9 菌株对掘氏疫霉菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of CL9 strain on Phytophthora drechsleri

表2 抑制作用较强菌株发酵液对抗掘氏疫霉的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of strong strain fermentation liquor against Phytophthora drechsleri

2.3 掘氏疫霉菌拮抗内生细菌的分子鉴定

将抑菌效果较强的拮抗菌（抑菌半径＞6 mm，菌丝抑制率＞ 40.0%）进行16S rDNA 序列测定及同源性分析（表3），并构建系统发育树（图3）。从表3 可以看出，CL9 和CL15 分别与Pseudomonas f lavescens和Staphylococcussp.亲 缘关系最近，同源性分别达到99.72%和99.93%；CL7 与Pantoea wallisii同源性为99.58%。

图3 基于16S rDNA 序列构建的拮抗内生细菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of antagonistic endophytic bacteria based on 16 SrDNA sequences

表3 拮抗内生细菌的16S rDNA 序列相似性分析Table 3 Similarity analysis of 16S rDNA sequences of antagonistic endophytic bacteria

经分子鉴定，确定具备较强拮抗效果的3 株内生细菌分别属于泛菌属Pantoeasp.（CL7）、假单胞菌属Pseudomonassp.（CL9）和葡萄球菌属Staphylococcussp.（CL15）。

3 讨论

黄瓜疫病发生普遍，黄瓜各个部位均可被侵染，造成幼苗猝倒、茎杆枯死、果实腐烂，严重时可导致绝产，对黄瓜产量影响很大。黄瓜疫病暴发突然，采瓜季节易造成黄瓜植株成片枯死，使黄瓜减产60%以上。青海、海南、江苏等地都曾有过黄瓜疫病大面积暴发的案例。黄瓜疫病的防治方法主要以农业防治（利用云南黑籽南瓜作砧木与黄瓜嫁接，利用太阳能对土壤进行消毒等）和化学防治（用72.2%霜霉威水、18.7%烯酰·吡唑酯水等）为主。这些防治措施受地理气候等因素影响，有多种局限性；而且化学试剂毒性强，在植物和土壤中停留时间长，容易使霉菌产生抗药性，对人类和环境造成威胁［11-13］。现有研究报道称，植物内生细菌不仅可以促进宿主植物生长、产生次生代谢产物，还可以增强宿主的抗逆性［14］。马东丽等以曼陀罗叶片为材料分离得到的内生细菌MY1 对谷瘟病菌等14 种植物病原真菌均有良好的抑菌效果，可以证实植物内生细菌具有增强宿主抗逆性的特点［15］。本研究以黄瓜叶片为材料发现对掘氏疫霉菌有较强抑制作用的3 株拮抗菌株，这3 株拮抗菌株分别属于泛菌属Pantoeasp.、假单胞菌属Pseudomonassp.和葡萄球菌属Staphylococcussp.，为植物内生菌相关研究提供材料，同时为利用植物内生细菌进行生物防治提供了有效思路。

利用植物内生菌防治植物病害异于传统方法，从植物-微生物互作、微生物之间互作、微生态等角度研究植物病原菌的防治绿色环保，具有很强的潜在应用价值［16］。Gao 等发现芽孢杆菌SXKF16-1 对茄花镰刀菌和尖叶镰刀菌具有明显的拮抗作用，能增加根区土壤细菌多样性，在防治土传病害黄芪根腐病的应用上有良好的研究前景［17］；Wang 等研究证实丹参内生真菌抗真菌效果显著，对改善作物品质和生产具有重要意义［18］。目前，应用最广泛的拮抗微生物主要有链霉菌、芽孢杆菌、类芽孢杆菌及假单胞菌等［19-21］。芽孢杆菌具有促进植物生长的功能并应用于多种植物病原菌的生物防治，通过分泌细胞外代谢物如抗生素、细胞壁水解酶和铁载体等表现出拮抗活性［22］。而本研究筛选出的内生细菌假单胞菌属（Pseudomonassp.）CL9 对掘氏疫霉菌表现出较强的拮抗效果，其发酵液也存在很强的抑菌作用，说明该菌株也产生了某种抗菌物质，为后续深入研究内生拮抗细菌的抑菌作用机制提供良好的材料。

4 结论

本研究以黄瓜叶片为材料，根据菌株的特征差异分离得到32 株内生细菌，随后利用平板对峙法及发酵液拮抗法实验进行复筛，最终得到3 株掘氏疫霉拮抗菌株。通过分子鉴定确定其分别属于泛菌属Pantoeasp.（CL7,菌丝抑制率45.2%）、假单胞菌属Pseudomonassp.（CL9，菌丝抑制率54.3%）和葡萄球菌属Staphylococcussp.（CL15，菌丝抑制率40.2%）。