基于网络药理学与分子对接技术探讨黄芪治疗鼻炎的作用机制

刘小敏，邱海燕，苏杨，张乐乐，曹亚楠，陈加容，邹亮，胡樱凡

鼻炎（rhinitis）是一种由鼻腔粘膜炎症引起的上呼吸道疾病，表现为鼻塞、流鼻涕、鼻痒和打喷嚏等症状。鼻炎严重影响患者的生活质量，包括睡眠、工作效率等，并伴有严重的心理障碍，也是发展为哮喘的危险因素[1]。西医治疗鼻炎主要通过化药和手术等方式，但不良反应较多，需长期服药，患者顺应性差，疼痛感强，伤害鼻腔。近年来，中医药在改善鼻炎患者症状、提高患者生活质量等方面发挥着重要作用。

中医理论认为，鼻炎病机多为肺脾虚寒，卫阳不固，风邪趁虚而入所致。黄芪，性甘温，归肺、脾经，作为传统补益药之一，具有补脾升阳、益气固表等功效[2]。临床研究表明，黄芪颗粒[3]、黄芪注射液[4]、黄芪桂枝五物汤[5]、脱敏汤[6]、辛芪颗粒[7]、黄芪建中汤[8]等黄芩复方，均能够改善鼻炎患者的症状，在临床上取得较好疗效。现代药理研究表明，黄芪有效成分黄芪甲苷可通过下调JAK2/STAT6信号通路及ROS水平[9]，从而达到治疗鼻炎的目的；黄芪多糖可通过调节Th1/Th2免疫平衡改善大鼠鼻黏膜炎性症状[10]。目前，黄芪干预鼻炎的研究较少，对于黄芪治疗鼻炎的药效物质基础及作用机制尚不明确。因此本研究采用网络药理学与分子对接技术探讨黄芪治疗鼻炎的潜在药效物质和分子作用机制，以期进一步为黄芪治疗鼻炎的中医理论和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 黄芪活性成分及靶点收集

通过TCMSP数据库（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）检索黄芪的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选阈值，得到黄芪的活性成分。在TCMSP数据库检索活性成分的相关靶点，利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）获得对应的人源靶基因。利用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）检索在TCMSP数据库中无靶点的化合物的Canonical SMILES，通过Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）、Similarity ensemble approach数据库（http://sea.bkslab.org/）、PharmMapper数据库（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）对化合物潜在的作用靶点进行预测。

1.2 鼻炎相关靶点收集

在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）中，以“rhinitis”为关键词，检索与鼻炎相关的靶点。

1.3 黄芪治疗鼻炎潜在靶点预测

将黄芪活性成分的相关靶点及鼻炎相关靶点录入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），获取两者交集，即为黄芪治疗鼻炎的潜在作用靶点。

1.4 “活性成分-潜在靶点”网络构建及可视化分析

将活性成分和潜在靶点录入Cytoscape 3.7.2（https://cytoscape.org/）软件，构建黄芪与鼻炎“活性成分-潜在靶点”网络并进行可视化分析。

1.5 蛋白互作网络（PPI）的构建

将潜在靶点输入STRING数据库（http://stringdb.org/cgi/input.pl）构建黄芪抗鼻炎的蛋白互作网络（PPI）。定义物种为人，将最低互作评分下的“high confidence”设定为0.9，同时隐藏游离的节点。使用R软件，得到前30名蛋白及节点连接数量的柱状图，连接数量的大小可直接代表节点在网络中的地位。

1.6 GO功能富集和KEGG通路分析

使用Bioconductor数据库（http://www.bioconductor.org/）、R软件及其下属包“clusterProfiler”对关键靶点进行GO功能富集分析（BP、CC、MF）和KEGG通路分析。选取P-value靠前的分析结果进行相应的可视化处理。

1.7 “通路-关键靶点”网络构建

运用Cytoscape 3.7.2软件对KEGG通路富集分析中得到的通路与整合的蛋白靶点构建“通路-关键靶点”网络。

1.8 分子对接

采用Vina软件对主要活性成分及关键靶点进行分子对接，验证网络药理学分析预测的可靠性。在PubChem数据库检索主要活性成分2D分子结构的SDF文件，使用ChemOffice软件进行优化，获得3D分子结构，保存为*.mol2格式。在PDB数据库（http://www.rcsb.org/）中下载关键靶点的三维结构，使用PyMOL软件删除靶点配体，保存为pdb格式。运用AutoDock Tools软件对大分子蛋白进行加氢，计算Gasteiger电荷，保存为pdbqt格式。设置相关参数，运用AutoDock Vina软件将化合物配体和靶蛋白受体对接，并使用PyMOL软件对对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 黄芪治疗鼻炎的活性成分及靶点的获取

从TCMSP数据库中共检索到黄芪相关成分87个，以DL≥0.18和OB≥30%为条件筛选，共获得21个活性成分（表1），通过TCMSP数据库检索活性成分所涉及的靶点并在Pubchem数据库中检索在TCMSP数据库中无靶点的化合物的Canonical SMILES，通过Swiss Target Prediction、Similarity ensemble approach、PharmMapper数据库对化合物潜在的作用靶点进行预测，经UniProt数据库筛选校正后，共获得339个靶点。

表1 黄芪治疗鼻炎潜在成分

2.2 鼻炎相关靶点收集

以“rhinitis”为检索词，从Genecards数据库中检索到2638个与鼻炎相关的靶点。将黄芪活性成分的339个靶点与鼻炎的2638个靶点取交集后，共获得147个交集靶点，对应16个活性成分。

2.3 “活性成分-潜在靶点”网络的构建

将16个活性成分与147个交集靶点录入Cytoscape 3.7.2软件绘制“活性成分-潜在靶点”调控网络（图2），红色三角形代表活性成分，蓝色方块代表靶点，每条边代表活性成分与作用靶点之间的关系。图中共包含163个节点，280条边。结果显示主要活性成分有槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、芒柄花黄素（Formononetin）、异鼠李素（Isorhamnetin）、毛蕊异黄酮（Calycosin）、黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）等，推测其可能是黄芪发挥治疗鼻炎作用的主要活性物质，体现了黄芪治疗鼻炎多成分、多靶点的特点。

2.4 蛋白互作网络（PPI）构建

将147个交集靶点输入STRING数据库构建联系紧密的PPI网络（图3），圆形节点表示不同的基因蛋白，节点连线代表蛋白之间的相互关系。图中包含147个节点、1366条连线，连接数量的大小可直接代表节点在网络中的地位。利用R软件对靶点间的连线进行计数，绘制连接数目处于前30的柱状图（图4）。结果显示TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、JUN等处于核心地位，可能是黄芪治疗鼻炎的关键靶点。

2.5 靶点的GO富集分析和KEGG通路分析

使用R软件和Bioconductor加载包，以P≤0.05对147个交集靶点进行GO富集分析，选择排名前20的结果进行可视化处理（图5）。其中，生物过程（biological process）共富集到2385条，主要涉及脂多糖反应、活性氧响应、氧化应激反应、细胞外刺激反应、固有凋亡信号通路调控等。细胞组分（cellular component）共富集到75条，主要涉及细胞膜筏、胞质、泛素连接复合物等。分子功能（molecular function）共富集到140条，主要涉及细胞因子、受体、蛋白激酶活性等。体现了黄芪可能通过调控多个GO功能来治疗鼻炎。

KEGG通路富集分析共得到166条相关通路（P<0.001），选择排名前20的结果（表2）进行可视化分析（图6、图7），可知基因主要集中在流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路等通路上。以上KEGG富集分析结果表明黄芪可通过调节不同类型的信号通路发挥治疗鼻炎的作用。

表2 黄芪治疗鼻炎的通路

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2.6 分子对接分析

根据网络分析结果，选择槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、异鼠李素5个主要活性成分与TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA 5个关键靶点进行分子对接。对接效果表现为结合能，结合能小于0表示配体与受体可自发结合，且结合构象越稳定，结合能越低，结合能< -5.0 kcal﹒mol-1表明具有良好的结合活性，当结合能< -7.0 kcal﹒mol-1时，有强的结合活性。结果显示（表3），主要活性成分与靶点的结合能均小于-5.0 kcal﹒mol-1，表明通过网络药理学筛选得到的活性成分和靶点具有良好的结合活性，预测结果较为可靠。

表3 黄芪中活性成分与靶点的结合能

为明确靶点蛋白与对应活性成分之间的结合活性，选择6个对接能量较小的结果进行展示（图8）。结果表明，Quercetin与TNF中的ARG-32、ALA-33、ASN-34、HIS-15、LEU-93、GLY-148、GLU-146、PHE-144残基结合，与TP53中的THR-246、GLN-248、LYS-107残基结合，与AKT1中的LYS-179、GLY-159、GLY-162、PHE-161残基结合；Calycosin与TNF中的VAL-150、GLY-148、ALA-33、ARG-32残基结合；Isorhamnetin与TP53中的LEU-195、ARG-80、ASN-278、ARG-337残基结合；Kaempferol与AKT1中的ASP-292、LYS-276、SER-7、THR-6残基结合，可观察到靶点与活性成分均具有良好的结合位点，并借助氢键等分子间作用力，形成较稳定的构象。

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3 讨论

鼻炎是一种儿童和成人常见的异质性慢性疾病，在全球范围内呈上升趋势，严重影响着患者的生活质量，其病机主要是肺脾虚寒。“黄芪，补肺健脾，卫实敛汗，驱风运毒之药也...”（《本草汇言》），药用历史长达2000多年。现代药理研究发现，黄芪可有效减轻鼻黏膜炎性症状[11-13]，从而发挥治疗和预防鼻炎的作用，但具体药效物质基础和作用机制仍不明确。本研究运用网络药理学及分子对接技术探讨黄芪治疗鼻炎的主要活性物质及其作用机制，体现了黄芪可“多成分，多靶点，多通路”共同作用治疗鼻炎。

从“活性成分-潜在靶点”网络图可知，槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、异鼠李素、黄芪甲苷等可能是黄芪治疗鼻炎的主要活性成分。研究表明，槲皮素可通过调节Th1/Th2细胞因子平衡[14]、降低总IgE和卵清蛋白特异性IgE水平[15]改善大鼠鼻黏膜炎症程度，减轻鼻炎症状；山奈酚是一种有效的抗炎活性物质，可通过抑制IL-32、TSLP以及caspase-1的活性发挥抗鼻炎作用[16]；毛蕊异黄酮[17]和异鼠李素[18]可抑制TNF‐α、IL-6、ⅠL‐1β等炎症细胞因子的水平以增强抗炎作用；芒柄花黄素可提高小鼠免疫细胞的吞噬功能及溶菌酶的杀菌活性，提高小鼠的适应性体液免疫功能[19]；黄芪甲苷可通过调节Th1/Th2细胞因子平衡，调节T-bet、GATA-3、Foxp3和RORγt的表达[20]，抑制HMGB1/TLR4/NF‐κB通路减少促炎因子的产生[21]来缓解鼻炎症状。PPI网络分析表明，黄芪治疗鼻炎的关键靶点有TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等。研究表明，TP53是鼻炎、哮喘发病过程中的关键节点基因[22]；IL-6、TNF‐α作为炎症细胞因子与鼻炎的发生有着密切联系[23]；VEGFA可刺激血管内皮细胞增殖，通过促进血管通透性调节鼻粘膜组织的炎症反应[24]；PI3K/AKT信号通路在鼻炎发病机理中具有重要作用，而AKT是该途径中的关键节点[25]。如上所述，槲皮素、山奈酚、异鼠李素等黄芪中的主要活性成分可能通过作用于TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等关键靶点，发挥改善炎症反应、增强免疫功能的作用以治疗和改善鼻炎。

通过GO功能富集和KEGG通路富集分析发现，黄芪可能通过参与脂多糖反应、氧化应激反应、固有凋亡信号通路调控等生物学过程，在细胞膜筏、胞质等部位，发生酶结合、细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子反应，进而调控流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等发挥治疗鼻炎的作用。流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路主要与血液流变学有关，较低的血流剪切力易导致动脉硬化形成或斑块破裂、内皮损伤，较高的血流剪切力有利于维持血管内皮的正常功能，保护血管内膜[26]；在TNF信号通路中，TNF‐α可以使NF‐κB等上调而诱导细胞炎症的发生，与鼻炎的发生机制有一定的联系[27,28]；IL-17信号通路在鼻炎的发病机制中起着关键作用，IL-17是一种主要由辅助性T细胞等分泌的促炎性细胞因子，在鼻炎患者血清中高度表达[29]；AGE/RAGE信号传导的引发涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、蛋白激酶C和MAPK的多种细胞内信号通路的激活，以及促进IL-6、TNF‐α等炎症细胞因子的表达，与鼻炎的发生有着密切的联系[30]。

分子对接结果显示黄芪的5个主要活性化合物槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、异鼠李素与TP53、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA5个核心靶点均表现出良好的结合活性，结合位点具有稳定的氢键，构象稳定，从而验证网络药理学的筛选结果。

综上所述，本文采用网络药理学和分子对接技术系统地分析了黄芪治疗鼻炎的作用机制，证明了黄芪对治疗鼻炎具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，揭示了黄芪中槲皮素、山奈酚、异鼠李素等潜在药效成分，通过作用于AKT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA等多个靶点，调控流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等，参与炎症反应、糖脂代谢、氧化应激等发挥治疗鼻炎的作用，为深入探讨其发挥作用的药效物质基础和作用机制提供参考与研究思路。后续可通过体内外实验对活性成分和核心靶点进行验证，以进一步明确黄芪治疗鼻炎的作用机制。