犀角地黄汤对咪喹莫特诱导的BALB/c小鼠银屑病模型IL-23/IL-17/IL-22轴的作用机制研究

周学丽、袁世清、李春霄、左小红、吴军、万鹏，

银屑病是一种常见的以表皮角化不全、白细胞浸润、真皮毛细血管扩张为特征的慢性遗传性炎症性疾病[1]。全世界各地均有银屑病病例发生，其患病率为2-3%[2]，甚至高达4.8%[3]，其中20%患者已发展为重度银屑病，并伴有高风险的非皮肤癌证[4]。银屑病的发病机制非常复杂，被认为与先天和获得性免疫反应、遗传因素、环境因素和代谢紊乱等多种因素有关。其中，L-23/IL-17/IL-22轴是诱发银屑病患者皮肤炎性细胞大量浸润和表皮过度增生的主要诱因[5]。

银屑病的传统治疗手段很多，但其疗效却并不令人满意。外用药物和光疗或全身药物的组合已经被很好地确定为影响大面积的中到重度银屑病的治疗方案[6]，然而仍然需要新的方法和药物来提高治疗效果[7]。传统中医药在治疗银屑病方面积累了丰富的经验，犀角地黄汤作为治疗银屑病的常用经典方药之一，其良好的临床疗效已被越来越多研究所证实[8-10]。本研究采用犀角地黄汤对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠进行干预，通过系统观察和分析小鼠皮损的临床与组织病理学改变、血清中与L-23/IL-17/IL-22轴相关的炎症因子的表达情况等，以期探索犀角地黄汤治疗银屑病的疗效机制，从而为银屑病的中医药临床防治提供有效经验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c小鼠，SPF级，体质量18～22g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（川）2020-030。

1.1.2 实验药物 犀角地黄汤药物组成：水牛角30 g，生地30 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g。制备方法：称取各药材，用水煎煮制备，共煎煮2次，煎出液合并，浓缩到每剂药85 ml。犀角地黄汤的人体推荐摄入量为85 g/d生药，相当于1.42 g﹒kg-1﹒d-1生药（成人以60 kg计）。

1.1.3 主要试剂 甲氨蝶呤片（珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，国药准字H20040283），5%咪喹莫特乳膏（上海上药信谊药厂有限公司，国药准字H31020644）。白细胞介素‐1β（ⅠL‐1β）、白细胞介素-17（IL-17A）、白细胞介素-22（IL-22）、白细胞介素-23（IL-23）、肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；其余常规试剂均为分析纯。

1.1.4 主要仪器 酶标仪DENLEY DR AGON Wellscan MK 3（Thermo），洗板机Wellwash 4 MK2（Thermo），数字显示隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS（上海跃进医疗器械厂），离心机TGL-16B（上海安亭科学仪器厂），移液枪Thermo labsystems、漩涡混合器XW-80A（上海青浦沪西仪器厂），电热恒温鼓风干燥箱DHG-9023A（上海精宏实验设备有限公司），连续分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group），高通量组织研磨器（宁波新芝）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及给药方法 将60只BALB/c小鼠随机分为6组，每组10只，即：正常组、模型组、甲氨蝶呤（2 mg﹒kg-1﹒d-1）对照组、犀角地黄汤低（8.7 g﹒kg-1﹒d-1）、中（17.4 g﹒kg-1﹒d-1，相当于临床等效剂量）、高（34.8 g﹒kg-1﹒d-1）剂量组。以戊巴比妥钠（36 mg/kg）经腹腔注射麻醉后，进行小鼠背部脱毛，面积2×3cm，休息3天后开始实验。

除正常组涂抹凡士林外，其余各组每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特（IMQ）乳膏，剂量为62.5 mg，每日1次。间隔4小时后，各组给予相应药物灌胃，每日2次，连续8天。空白组和模型组给与等量的生理盐水。

1.2.2 PASI评分 依据银屑病皮损严重程度指数（PASI）评分标准，每日照相记录和评价小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润程度的情况积分。三项症状评分分别为0-4分。其中0：无症状；1：轻度；2：中度；3：重度；4：极其严重。三者评分之和为总评分，0-12分，总评分越高表示皮损越严重。

1.2.3 皮损取材 各组小鼠于给药8 d后取材，摘双侧眼球取血，同时按照九格法剪取各组相对应皮损处组织保存待用。最后采用戊巴比妥钠（36 mg/kg）腹腔注射麻醉处死小鼠。

1.2.4 苏木精-伊红（HE） 取出小鼠背部皮肤组织后进行酒精梯度脱水，二甲苯透明，用石蜡包埋后制备切片。使用苏木精-伊红（HE）染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察表皮变化。

1.2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） 采用酶联免疫吸附测定（ELISA法）检测对各组小鼠血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α等炎性细胞因子进行定量分析，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用IBM SPSS26.0和Graphpad Prism8.0软件进行统计分析。同一时间多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较用LSD法，检验水准α=0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 犀角地黄汤对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的影响

根据PASI评分标准，实验第3天起，模型组小鼠背部皮肤开始出现红斑、鳞屑等皮损，其程度随实验进行而逐渐加重，至第8天最为严重，表现为大面积红斑、被覆鳞屑、明显浸润等。与模型组比较，正常组皮肤无明显变化，甲氨蝶呤组红斑和鳞屑等银屑病样症状均明显减轻，犀角地黄汤各剂量组表现出与甲氨蝶呤组相同的发展趋势。PASI评分显示，除正常组外，其余各组分值均逐日有不同程度的增加；与模型组比较，犀角地黄汤各剂量组与甲氨蝶呤组评分均有所降低，其PASI总分自第3天起差异开始具有统计学意义（F=3.107，P＜0.05）。提示犀角地黄汤在该模型中具有抑制银屑病样皮损产生的作用（见图1、图2）。

2.2 犀角地黄汤对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损组织学的影响

HE染色结果显示（见图3），正常组、模型组、甲氨蝶呤组和犀角地黄汤低、中、高剂量组的皮肤组织状态具有明显差异。与正常组比较，模型组可见表皮角化过度及融合性角化不全，颗粒层增厚，牟罗微脓肿，真皮浅层炎症细胞浸润，真皮血管扩张，扭曲、充盈，表皮散在中性粒细胞浸润，呈银屑病型增生，提示造模成功。与甲氨蝶呤组效果相近，犀角地黄汤高、中剂量组明显改善IMQ诱导的银屑病样皮损。

2.3 犀角地黄汤对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠血清中IL-23/IL-17/IL-22轴等相关炎性细胞因子表达的影响

与正常组相比，模型组小鼠的血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α均大量表达。与模型组相比，甲氨蝶呤组和犀角地黄汤各剂量组均显著抑制了ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α炎性细胞因子的过量表达（P＜0.05），差异有统计学意义。但与甲氨蝶呤组相比，犀角地黄汤各组的抑制作用相近（P＞0.05），低、中、高剂量组之间作用亦相近（P＞0.05），差异无统计学意义（见图4）。

3 讨论

银屑病是一种T细胞介导的慢性炎症性皮肤病，病理特征主要为表皮角质形成细胞过度增殖和异常分化[11,12]，临床以红斑和银白色鳞屑为主要表现。2008 年我国开展的一次大规模银屑病流行病学调查[13]发现，我国银屑病标化患病率为0.47%，提示我国银屑病患病率呈现上升趋势。由于银屑病病因复杂、病程长、易复发，常给病人带来生理、心理、社会等多方面的不良影响，严重影响病人的生活质量[14]。然而，银屑病的临床治疗难度较大，部分治疗方案不仅效果欠佳，还可导致严重的不良反应[15]。不仅如此，银屑病的治疗费用还颇为昂贵，根据美国全美银屑病基金会的数据显示，每年直接和间接用于银屑病的费用已经超过了110亿美元[16]，其中尤以生物疗法最为昂贵[17]。因此，为了筛选出疗效优良、副作用小、费用低廉的治疗药物，有必要进一步开展传统中医药防治银屑病的相关机制研究。本研究采用咪喹莫特诱导成功建立了银屑病小鼠模型。根据PASI评分和HE染色结果发现，与模型组比较，犀角地黄汤各剂量组红斑、鳞屑、浸润等银屑病样症状均明显减轻，与甲氨蝶呤组效果相近，提示犀角地黄汤在该模型中具有抑制银屑病样症状产生的作用。

以往的研究已经发现，银屑病皮损中Th17细胞数量增加，IL-17A、IL-22、IL-23等细胞因子水平升高，在银屑病发病机制中起主要作用[18-20]。IL-17能诱导角质形成细胞表达趋化因子如CCL20、CXCL1等[21,22]，它们可以招募更多的炎症细胞到达银屑病的皮肤病灶。同时，这些炎症细胞或者角质形成细胞又能产生TNF‐α、ⅠL‐1β、IL-6等细胞因子，反过来刺激树突状细胞产生IL-23，从而形成一个炎症应答级联放大的循环体系[23]。此外，角质形成细胞还具有细胞因子受体，可作为活化的T淋巴细胞来源的IL-17和IL-22的靶标，从而促进角质形成细胞的增殖、异常分化和进一步产生细胞因子[24]。本研究小组通过ELISA法检测各组小鼠血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α等炎症因子含量，结果提示，与模型组比较，犀角地黄汤各剂量组可以降低银屑病样小鼠上述炎症因子的表达。

综上所述，作为中医药凉血消斑法的代表方剂，犀角地黄汤可以改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损，其机制可能与降低L-23/IL-17/IL-22轴相关炎性细胞因子，从而发挥抗炎功能有关。