基于牡荆素的绿豆大曲质量控制方法研究

谭利, 高廷会，王松涛，黄张君，李阳，沈才洪，国锦琳

马王堆《十问》记载“酒者，五谷之精气也…故以为百药由。”《汉书·食货志》：“酒为百药之长”。药酒同源，从马王堆以来药酒处方历代传承创新。近代以来，国内外许多机构开展酒精损害人体的实验，但白酒不是酒精[1]，添加含有明确药用价值的功效成分的养生保健酒也不再是传统意义上的白酒。

绿豆为豆科植物绿豆（Phaseolus radiatusL.）的种子，又名青小豆、菉豆、植豆等，在历代本草中记载绿豆能清热，补益元气，解酒食等。《本草纲目》记载：“绿豆，消肿治痘之功虽同于赤豆，而清热解毒之力过之。可“解金石、砒霜、草木一切诸毒”[2]。《开宝本草》中记载绿豆：“主丹毒烦热，风疹，热气奔豚，生研绞汁服。亦煮食，消肿下气，压热解毒。” 《普济方》记载绿豆能治痈肿疮毒。清热解毒，以消痈肿。可广泛用于热毒、疮痈肿毒。现代研究发现绿豆的主要生理活性成分为黄酮、多糖、多肽等[3-4]，有增强机体免疫功能、抗炎、抗肿瘤、保肝、利尿、抗氧化等作用[5-12]。

绿豆大曲是以绿豆为主的复方提取液制成的养生酒，具有潜在的保肝功效。绿豆保肝作用的主要生理活性成分是黄酮类成分，牡荆素是绿豆黄酮的主要成分，占比达到98%[13]，文献报道牡荆素在绿豆粉末中检测含量为1.04~1.71 mg﹒g-1[14]。养生酒的质量评价一般采用功效成分指标[15-18]，目前绿豆大曲尚未确定功效成分质控指标。本研究应用HPLC-MS/UVD筛选绿豆大曲中与绿豆提取液共有的黄酮成分，将其作为质控指标建立质控方法对绿豆大曲功效成分添加的一致性进行质量控制。

1 材料

1.1 材料与试剂

由泸州老窖股份有限公司提供20批酒样，A类酒样（酒精度标示值41.8%vol）10批次（批号210101-210110），B类酒样（酒精度标示值51.8%vol ）10批次（批号210101-210110）。

无水乙醇为分析纯，购买自成都市科隆化学品有限公司。牡荆素（CAS号3681-93-4，批号17022705）购买自成都普菲德生物技术有限公司，对照品质量分数≥98%。乙腈、甲醇纯度为色谱级，购买自Fisher公司，水为超纯水。

1.2 仪器与设备

DHG-系列电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），SB-120DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），SIGMA 318-KS冷冻离心机（德国SIGMA公司），LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司），LC-MS-2020型单四极杆液质联用仪（日本岛津公司），ME204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），GM-1.0A 隔膜真空泵（天津津腾实验设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取牡荆素约0.0010 g，60%乙醇定容至5 mL，配制0.20 mg﹒mL-1牡荆素标准溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精确称取绿豆粉末2 g（精度至 0.1 mg）于50 mL离心管中，加入 60%乙醇 40 mL，超声萃取 90 min，6000 r﹒min-1离心 10 min，温度20 ℃，收集上清液；用60%乙醇定容至50 mL，得绿豆提取液；绿豆大曲和基酒样本由泸州老窖股份有限公司提供，不做其他处理，直接分析。

2.3 酒样中牡荆素定性分析

2.3.1 色谱条件InfinityLab Poroshell 120 EC- C 18（4.6 mm×100 mm，2.7 Micron）色谱柱；以乙腈（A）和超纯水（B）为流动相；梯度洗脱：0 ~ 10 min，5 ~ 20% A；10 ~ 15 min，20～40% A；15 ~ 25 min，40% A；25 ~ 50 min，40～100% A；50~ 60 min，100% A；60～60.1min，100～5%A。流速0.3 mL﹒min-1；柱温40 ℃[19]。

2.3.2 质谱检测采用LCMS-2020单四级杆液质联用仪，采用选择离子模式（SIM），选择负离子模式，检测离子m/z（-）431.0。雾化气流量：1.5 L﹒min-1，干燥气流量15 L﹒min-1。[20]

2.3.3 分析结果 由牡荆素标准溶液HPLC-UVD检测色谱图（图1），可见牡荆素在该色谱条件下保留时间为16.3 min。HPLC-MS选择离子模式（SIM）检测绿豆提取液与绿豆大曲中的牡荆素分子离子m/z(-)431.0色谱图（图2）中在16.3 min处均有峰，说明两样品中均有牡荆素，牡荆素为绿豆提取液与绿豆大曲共有黄酮成分。

为明确酒样中的牡荆素来源，比较了绿豆大曲与其配制基酒在上述相同条件分析的HPLC-UVD色谱图（图3），可见16.3 min处绿豆大曲色谱峰，该峰峰面积占比为52.2%，而基酒色谱图无此峰，说明基酒中无牡荆素。可确定绿豆大曲中的牡荆素来源于绿豆复方提取液。因此，筛选出牡荆素作为对绿豆大曲中添加绿豆提取液一致性的质控指标。

2.4 酒样中牡荆素含量测定

2.4.1 色谱条件同“2.3.1”。

2.4.2 紫外检测采用LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司) ，紫外可见光检测器，检测波长300 nm；进样量5 μL。

2.4.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于1 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线。配制成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg﹒mL-1系列浓度的标准溶液。按照“2.3.1”的色谱条件进行分析。以对照品浓度C（mg﹒mL-1）为横坐标，以峰面积积分值A为纵坐标，经过回归处理后得回归方程为：A=2*107C-29818，R值为0.9996，线性范围为0.02~0.12 mg﹒mL-1，表明在此浓度范围内有良好的线性关系。

2.4.4 供试品溶液中牡荆素含量的测定 参照“2.3.1”和“2.4.2”的方法对泸州老窖股份有限公司提供的20批酒样进行测定，20批酒样含量测定结果见表1。由表1可见两类绿豆大曲中牡荆素浓度范围为0.03~0.07mg﹒mL-1。

表1 绿豆大曲中牡荆素的浓度（mg﹒mL-1）

2.4.5 稳定性试验 精密吸取同一份绿豆大曲溶液，在“2.3.1”色谱条件下，分别在0、2、4、8、16、24h进样，记录不同时间测得的牡荆素的峰面积。稳定性试验计算得RSD值为2.59%，表明样品在24 h内稳定性良好；

2.4.6 精密度试验 精密吸取绿豆大曲供试品溶液，在“2.3.1”色谱条件下连续进样6次，记录牡荆素的峰面积。精密度试验计算得RSD为2.43%，小于5%，表明仪器精密度良好；

2.4.7 重复性试验 取同一批绿豆大曲制备6份样品，在“2.3.1”色谱条件下测定，记录牡荆素的峰面积，计算其质量分数。重复性试验计算得RSD值为0.81%，证明方法重复性良好；

2.4.8 加样回收率试验 精密量取6份已知牡荆素含量的同一批绿豆大曲，每份0.50 mL，精密加入牡荆素对照品溶液0.15mL，混匀，按“2.3.1”的色谱条件测定峰面积，计算其回收率。加样回收率试验计算得牡荆素的平均回收率为103.8%，RSD为2.78%（n =6），符合要求。

表2 绿豆大曲酒样加样回收率实验结果

2.3 数据统计方法

2.3.1 使用GraphPad Prism 9对两批数据进行分析 采用Nested 作图方式对两批数据离散程度进行分析。绘制样品牡荆素浓度分布图（图4），B类酒样中存在异常值，认为异常值样品不符合制订一致性标准的样品要求，因此将该样品数据去掉后计算绿豆大曲两类样品牡荆素浓度均值分别为0.04 mg﹒mL-1和0.06 mg﹒mL-1。

2.3.2 使用SPSS 23.0对数据进行分析处理 采用独立样本T检验比较两类酒样牡荆素含量是否有显著性差异。经SPSS分析P=0.003，以p<0.05判断两类酒样牡荆素含量有显著性差异，因此两类酒样需要分别制定质量控制标准。以符合一致性样品牡荆素均值的80%为标准，制定指标值为A类酒样牡荆素浓度不低于0.03mg﹒mL-1，B类酒样牡荆素浓度不低于0.05 mg﹒mL-1。

3 讨论与结论

在对黄酮类成分的检测中，绿豆提取液除牡荆素之外，芸香柚皮苷、山奈酚-3-O-葡萄糖甙、二氢槲皮素、芦丁、葛根素等多种黄酮成分亦有检出，但含量远低于牡荆素，当绿豆提取液作为添加原料调制为绿豆大曲，仅有含量高的主要黄酮成分牡荆素能被检出。同时，经检测验证，绿豆大曲中的牡荆素来源于绿豆提取液而非调配用基酒，因此选择牡荆素作为质控指标。

常规酒样用总酸、总酯、风味物质等进行质控，本文旨在从保健酒的功效成分筛选质控指标，突出保健酒的质控特点。绿豆大曲中添加的主要功效原料是绿豆，牡荆素是绿豆中主要黄酮类成分，在绿豆大曲的质量控制中采用牡荆素为化学成分指标具有定性和定量两方面的意义，定性方面是确定在绿豆大曲中加入了以绿豆为原料的功效组分，确保绿豆大曲养生酒的基础物质稳定；定量方面意义则是功效成分的加入浓度对产品的影响得到控制，以及有效成分含量在生产过程中得到保证。从此次测定结果能够发现，以牡荆素含量来指控样品酒的质量，能够发现不同批次样品酒中的异常值，反映了该指标能表征样品间的不一致情况，说明了指标选择的合理性。

根据此篇文章研究表明，原料明确的养生酒在选择质控指标时，优先考虑从主要原料中选择功效明确且含量较多的成分作为指标成分，这也为养生酒行业其他类产品制定质量标准提供了一定的思路与方法。

方法学考察结果显示，样品测定的稳定性、精密度、重复性等均是符合要求的，选择HPLC-UVD测定绿豆大曲中的有效成分含量准确、快速。此次实验不足之处，样本量少，测出的结果仅供初步参考，整个产品的质量控制标准有待于进一步分析验证。保健酒中来源于功效添加原料的主要功效成分可作为质控指标，为对产品功效添加一致性提供定性定量方法。