基于网络药理学研究宽筋藤治疗特异性皮炎的作用机制

龚娟，杨华，唐雪勇，戚东卫

特异性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一种常见的慢性、瘙痒性、炎症性皮肤病，表现为炎性、渗出性皮损、苔藓化及皮肤干燥，部分患者病情迁延终生严重影响患者生活质量[1]。AD发病于各个年龄段，常见于婴儿、青少年以及成年人，多发于婴幼儿。30%的儿童与8%的成年AD患者常伴有焦虑、睡眠障碍以及抑郁，对其生活质量造成要重影响[2]。高昂的医疗费用、患者生活质量的下降以及一定的死亡率使AD成为了一个全球性的健康问题。相关研究表明：遗传、环境、皮肤屏障破坏以及免疫功能障碍是目前AD公认的病因[3]。近年来，随着研究的不断深入发现AD发病与Th1/Th2失衡密切相关[4]。

宽筋藤（Tinospora sinensis (Lour.) Merr.），别名松根藤、大松身、中华青牛胆以及牛挣藤等，是防己科青牛胆属植物中华青牛胆的藤茎，主产于西藏、四川云南以及两广地区，其药用部位为藤茎，全年均可采收，其味苦、性凉，归肝经，具有舒筋活络，祛风止痛之效，在临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、坐骨神经痛、骨折等[5]。宽筋藤最早出现在清代的《生草药性备要》，书中记载：“一名火炭葛”。在《陆川本草》中曰：“一名青宽筋藤，一名四方藤”，书中首次出现宽筋藤药名。民国的《岭南采药录》曰：“…酒浸舒经络…治气节疼痛…”，该书对其功效有较为详细描述。现代药理学研究表明：宽筋藤具有抗寄生虫、抗辐射、抗炎、镇痛、抗氧化、保肝、调节免疫等作用，在临床上广泛用于风湿关节炎、腰腿疼痛，关节僵硬，骨折等[6-8]。宽筋藤是重庆市中医院皮肤科协定处方抗炎2号的主要药物之一，在临床上广泛用于AD的治疗，月使用量在1000副以上，收获较为理想的治疗效果。现代植化研究结果提示：生物碱、黄酮、木脂素、苯丙素、倍半萜及二萜、酚苷等是其主要的化学成分[9,10]。然而，宽筋藤药效物质基础以及药理学分子作用机制仍有待进一步研究。中药的多成分、多靶点、低选择及协同作用是中药药理研究面临的最大难题，网络药理学通过计算机的强大运算能力，结合药学、系统生物学及多层次网络分析的新技术，以小分子化合物、靶点、信号通路等多角度着手，能够有效预测中药的有效成分与作用靶点，阐释中药的作用机制[11]。网络药理学在中药研究中已经凸显出具有独特的优势以及较大的潜力。本研究采用网络药理学方法研究宽筋藤治疗AD的药效物质基础与分子机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 活性成分的筛选

以“宽筋藤”为关键词检索中药系统药理学分析平台（TCMSP http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/），收集宽筋藤的有效成分及靶点。以生物利用度（oral bioavailability，OB），类药性（drug-like）分别大于等于30%，0.18，并适当补充文献中发现的新化合物。

1.2 AD相关联靶点的获得

通过疾病数据库（GenneCaeds，OMIM）查找与“特异性皮炎”（Atopic dermatitis，AD）具有密切联系的基因，获得与AD相关的基因。

1.3 活性小分子---靶点的网络构建

将收集到的宽筋藤活性小分子靶点及AD相关靶点交集,获取潜在宽筋藤治疗AD的靶点。梳理“宽筋藤-活性小分子-靶点-AD”的相关信息，使用Cytoscape 3.7.0软件获得“宽筋藤-活性小分子-靶点-AD”网络。使用插件（network analyzer）分析“活性小分子-靶点-网络图”。在构建好的网络中，活性小分子、靶点及通路使用节点（node）表示。某一些基因为某个活性小分子的潜在作用靶点，则用边（edge）相连接表示。

1.4 构建蛋白互作网络

为了阐明宽筋藤治疗AD潜在靶基因的相互作用，把1.3项下获得的交集靶点输入STRING（https://string-db.org/）平台构建构建蛋白互作网络（Proteinprotein-interaction，PPI），把最低互作阈值设为中等，其它参数保持不变。把构建好的PPI导入Cytoscape 3.7.0软件,使用network analyzer插件进行功能分析,确定宽筋藤治疗AD的关键基因。

1.5 功能分析

运用Bioconductor软件及R语言进行宽筋藤治疗AD的GO富集分析以及KEGG信号通路富集分析。

2 实验结果

2.1 宽筋藤有效成分及其靶点筛选

通过TCMSP，BATMAN-TCM数据库，以及文献分析，筛选获得符合1.1项下12个有效成分（quercetin，rutin，prolinum，DTY，tinosineside B，tinosinen，syringaresinol，dimethoxyglucopyranoside，benzyl Oglucopyranoside，cycloIleAla，cycloValTyr），同时获取了这些化合物靶点228个。

2.2 AD靶点的获取以及互作网络构建

通过GenneCaeds，OMIM疾病数据库查找与AD具有密切联系的基因，筛选出2301个基因。使用R语言将宽筋藤12个活性小分子的228靶点与AD疾病相关的2301个基因交联，获得宽筋藤有效成分治疗AD的潜在靶点，结果通过Venn图表示，如图1所示，结果显示共有113个靶点重合。将宽筋藤活性小分子靶点及AD疾病相关靶点输入STRING数据区，将收集到的宽筋藤活性小分子靶点及AD相关靶点交集，获取潜在宽筋藤治疗AD的靶点。梳理“宽筋藤-活性小分子-靶点-AD”的相关信息，使用Cytoscape 3.7.0软件获得“宽筋藤-活性小分子-靶点-AD”网络。使用network analyzer分析“活性小分子-靶点-网络图”，结果见图2。

2.3 构建PPI网络

把1.2项下Venn图中小分子---靶点与疾病靶点重合的交集中的113个基因，录入STRING蛋白相互作用数据库中，研究这些主要靶点之间的相互作用关系，并筛选主要的靶点信息。把STRING数据库中得到的蛋白互作信息输入Cytoscape 3.7.0软件，构建PPI网络模型，如图3所示。随后对PPI网络进行可视化以及拓扑分析得到30个核心靶点，它们分别是IL6，ALB，INS，VEGFA，AKT1，MMP9，IL1B，CXCL8，IL10，PTGS2，JUN，CCL2，ICAM1，CASP3，MAOK1，EGFR，MMP2，MYC，SRC，ESR1，IL2，VCAM1，CAT，HMOX1，MPO，ANXA5，CRP，IFNG，RELA，MMP1。这些靶基因相互作用较为紧密，在网络中起到了关键作用，详见图 4.

2.4 GO功能富集分析

对宽筋藤的30个核心药效靶点进行GO功能富集分析，发现细胞因子活性、细胞因子受体、蛋白激酶、蛋白磷酸化以及抗氧化活性主要参与了其生物学进程。生物进程包括了20条（图5A，B），包括cytokine receptor binding，cofactor biding，receptor ligand activity，receptor regulator activity，cell adhesion molecule binding，protein heterodimerizationactivity，endopeptidase activity，integrin binding，cytokine activity，heme binding，tetrapyrrole binding，phosphatase binding，protease binding，growth factor binding，growth factor receptorbinding，protein phosphatase binding，serine-type endopeptidase activity，oxidoreductase activity，antioxidant activity，transmembrance receptor protein kinase activity。

2.5 宽筋藤治疗AD的KEGG通路分析

将对宽筋藤的30个核心药效靶点导入数据库，进行KEGG通路分析。通过对交集靶点分析得到20条KEGG通路（图6 A，B），这些通路之间联系较为密切，并且每条KEGG通路均有多个靶点富集。AGE---RAGE signal pathway，Fluid shear stress and atherosclerosis，IL-17 signal pathway，TNF signal pathway，Chagas disease，C-type lectin receptor signaling pathway，Relaxin signaling pathway，Hepatitis B，Malaitis，Prostate cancer，Kaposi sarcoma-associated herpersvirus inferction，Bladder cancer，Leishmaniasis，Ⅰnfluenza A，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，Osteoclast differentiation，Proteglycans incancer，Tuberculosis，Toxoplasmosis。

3 讨论

目前，AD被认为是一种易复发的炎症性皮肤病，对患者生活质量造成了较大的影响。现阶段AD治疗药物有局部以及口服药物，主要包括糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂与免疫抑制剂[12]。糖皮质激素主要用于治疗中重度AD，与口服糖皮质激素相比，糖皮质激素软膏可有效的缓解AD相关症状，并能获得更高的安全性及有效性。与此同时，免疫抑制剂也收获了较为理想的疗效[13]。然而，糖皮质激素与免疫抑制剂造成了许多副作用以及耐药性问题。因此，副作用更小的治疗方案对提高AD患者的生活质量尤为重要。目前，中医药在在AD治疗上拥有一定的优势。多成分、多靶点、多通路是中药发挥治疗作用的重要特征，因此，这给阐释中药作用机制带来了许多困难。网络药理学是一种基于组学与系统生物学的技术，对系统全面阐释中药作用机制有较大的帮助。

本研究通过TCMSP，BATMAN-TCM数据库以及文献挖掘查找了宽筋藤的活性成分以及潜在作用靶点，并使用GeneCards，OMIM数据库查找了AD疾病相关靶点，通过R语言将宽筋藤的活性成分潜在作用靶点与AD疾病关联靶点取交集，共发现113个交集靶点因子。将获得的113个交集靶点输入STRING数据库，使用Cytoscape 3.7.0软件绘制PPI网络。对PPI网络进行可视化以及拓扑分析得到30个宽筋藤治疗AD的核心靶点。对这30个主要靶点分析发现细胞因子（IL-1B，IL-2，IL6和IL-10）主要参与了宽筋藤治疗AD。然而，AD现在被认为是Th2/Th1细胞失衡引起疾病，在AD急性发病期Th2细胞激活，Th2向Th1转变发生在AD的慢性期[14]。IL-4，IL-5，IL-10，IL-15，IL-15以及IL-25与急性期Th2细胞密切相关， IL-2，ⅠFN‐γ与AD慢性期Th1细胞密切相关。与此同时，研究者认为IL-4，IL-5，IL-10，TNF‐α，IL-1B和IgE与AD进程具有密切关系。本研究结果提示宽筋藤可能通过调控IL-1B，IL-2，IL6和IL10等细胞因子治疗AD。这些结果表明宽筋藤可能通过调控Th2/Th1细胞失衡发挥其治疗作用。同时，CCL2，CXCL8等参与T淋巴细胞募集到炎症部位[15]，本研究结果表明宽筋藤可能调节CCL2，CXCL8等趋化因子招募T淋巴细胞到炎症部位调节局部炎症。INS，VEGFA，AKT1，MMP9，JUN，MAPK1，EGFR，MMP2，IFNG等靶点均参与了调控趋化因子（CCL2，CXCL8）以及细胞因子表达（IL-1B，IL-2，IL6和IL10）。因此，这些富集到的核心靶点初步构成了宽筋藤的药效作用网络。GO功能富集分析表明细胞因子活性、细胞因子受体、蛋白激酶、蛋白磷酸化以及抗氧化活性主要参与了宽筋藤治疗AD的生物进程。对KEGG通路富集结果分析表明宽筋藤最有可能通过调控AGE---RAGE signal pathway，IL-17 signal pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，发挥其治疗作用。

综上所述，本研究采用网络药理学方法阐释宽筋藤治疗AD的潜在作用机制，阐述了宽筋藤多成分与多靶点的复杂网络相互作用关系，为进一步开展宽筋藤治疗AD的实验研究以及为其临川应用提供了理论依据。